siRNA表达载体的构建

siRNA表达载体的构建siRNA表达载体作为(1)后基因组时代基因功能分析的有力工具，(2)应用于基因组学、细胞信号传导途径分析；(3)用于药物目标筛选、疾病治疗。 实验方法原理：多种siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶启动子(pol)之一，调控发夹RNA(short hairpinRNA，shRNA )在哺乳动物细胞上的表达。 这三种启动子包括众所周知的人源、鼠源U6启动子和人H1启动子。 采用RNA polIII启动子是因为在哺乳动物细胞中能表达更多的小分子RNA，并且添加了1列(36个) u中止转录。 为了使用这种载体，需要订购两段编码短发剪辑RNA序列的DNA单链，进行退火，并克隆到该载体的pol III启动子下游。 由于与克隆有关，这个过程需要几周到几个月的时间，并且需要确定序列以确保克隆序列正确。 实验材料：目的基因试剂、试剂盒： LB培养基仪器、消耗品：离心管、离心分离机、水浴锅、涡流振荡器等实验程序：一、目的基因的确定1 .检索文献取得了实验有效的目标序列(对照)。 参照2.NCBI:http:/www.NCBI.NLM.NIH.gov /。 3 .搜索引擎辅助： or。 二、为了设计siRNA目标序列，需要单独设计siRNA序列。 对于哺乳动物细胞，最有效的siRNAs不是发现了21-23碱基大小，3端有两个突出碱基的双链RNA，长的dsRNA是有效的。 siRNA序列特异性要求非常严格，与目标mRNA的碱基失配显着损害基因沉默的效果。 1 .选择sirna靶部位，转录AUG的起始密码子，然后寻找下游AA序列，记录与aa3端相邻的19个核苷酸为候选的sirna靶部位。 有研究结果显示，GC含量为30%-50%左右的siRNA比这些GC含量高更有效。 Tuschl等人在设计siRNA时，由于5和3端的非编码区(untranslated regions，UTRs )中有丰富的控制蛋白结合区，因此这些UTR结合蛋白或翻译开始复合体是siRNP内核酶复合体与mRNA结合而成的，sir 2 .序列同源性分析将潜在序列和相应的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，排除其他编码序列/EST同源性序列。 例如，通过使用blast (www.NCBI.NLM.NIH.gov/blast/)选择合适的目标序列来进行合成。 并非所有满足条件的siRNA都有效，其原因不明，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般选择35个目标基因来设计siRNA。 通常，各目标序列设计siRNAs，以最有效地进行后续的研究。 3 .设计阴性对照的完整siRNA实验应具有阴性对照，阴性对照的siRNA应具有与所选siRNA序列相同的组成，但与mRNA没有明显的同源性。 通常会打乱选定的siRNA中的碱基序列。 当然，也必须保证与其他基因没有同源性。 三、表达载体的选择1 .化学合成和体外转录方法都是在体外获得siRNA后再导入细胞内，这两种方法主要有两方面不可克服的缺点： siRNA容易进入细胞分解； 进入细胞的siRNA在细胞内的RNAi效果的持续时间很短。 这种情况下，通过质粒、病毒系载体，siRNA的体内表达出现了。 这个方法的基本想法是，将对应siRNA的DNA双链模板序列克隆到载体的RNA聚合酶III的启动子中，可以在体内表达所需的siRNA分子。 该方法的整体优点是不需要直接操作RNA，可以获得长时间的基因沉默效果。 2 .质粒对siRNAs的表达多是用Pol III启动子编码shRNA(small hairpin RNA )的序列。选择Pol III启动子的原因是，该启动子总是在离启动子一定距离的位置开始复制合成RNA，遇到45个连续的u而结束，非常准确。 当这种具有pol启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，能表达siRNA的质粒确实可以降低特定基因的表达，抑制外源基因和内源性基因。 使用质粒的优点是，siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体就能更长时间抑制目标基因的表达。 当然，另一个是质粒可以复制放大，与其他合成方法相比，可以显着降低siRNA的制造成本。 3 .带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可持续抑制细胞中目标基因的表达数周或更长。 RNAi-Ready表达载体与逆转录病毒和腺病毒表达系统(BD Knockout RNAi Systems )集成，大大提高了siRNA表达载体对宿主细胞的感染性，彻底克服了某些细胞感染效率低的障碍，使哺乳动物细胞siRNAs瞬间表达四、合成了编码合成模板shRNA的DNA模板的两条单链，模板链后面有RNA PolyIII聚合酶转录中止部位，同时在两端分别设计了BamH I和hindi酶切断部位，siRNA载体多克隆部位的ba 2.95，5 min，慢慢退火，用DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。 五、将连接和转化100 l的受体细胞在冰上解冻。 将5 l的连接产物加入受体细胞中，轻轻旋转数次，混合内容物，在冰上放置30分钟。 3 .将软管放入预加热到42的水浴中，用热刺激90秒钟。 迅速将软管转移到冰浴中，将细胞冷却12分钟。 4 .每管加入700 l LB培养基，在37下振荡培养1小时，进行复苏。 5 .室温4千rpm下离心5分钟，丢弃上清后，以剩馀量100 l培养坪量悬浮细胞，涂布在含有抵抗性的LB琼脂平板表面上。 注意：细胞的用量根据连接效率和接受性细胞的效率来调整。 6 .将平板放置在室温下直到液体被吸收。 7 .把平盘倒过来，在37下培养，1216小时后就能生成菌落。 六、PCR鉴定和测序鉴定是在编码shRNA的DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物，扩增片段在100-200bp之间。 注意事项：1.从转录(mRNA )的AUG起始编码中寻找“AA”二连序列，记录其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA目标部位。 有研究结果显示，GC含量为30%50%左右的siRNA比这些GC含量高更有效。 Tuschl等人在设计siRNA时，因为5和3端的非编码区(untranslated regions，UTRs )中有丰富的控制蛋白键区，所以这些UTR键蛋白或翻译开始复合物影响了siRNP内核酸酶复合物的mRNA键2 .比较潜在序列和对应的基因组数据库(人、鼠、大鼠等)，排除与其他代码序列/EST相同的序列。 例如使用blast (www.NCBI.NLM.NIH.gov/blast/)来选择并合成适当的目标序列。 通常，一个基因需要设计多个目标序列的siRNA，找到最有效的siRNA序列。 4 .完整的siRNA实验应具有负对照，负对照的siRNA应与选定的siRNA序列具有相同的组成，但与mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是扰乱选定的siRNA序列，同样地检查结果，保证与其他基因没有同源性。 计划合成siRNA，可以直接提供以AA开始的21个碱基序列，制造商合成互补序列。 注意，特别地在通常组合的siRNA以3dtdt结束且以UU结束时进行描述。发现UU的最后和dTdT的最后siRNA没有有效的差异。 因为这个突出端不需要与目标阵列互补。 另外：一、siRNA操作的成功要点1 .为每个基因设计24个siRNA序列，为找到潜在的靶位，扫描靶基因的AA序列。 将aa3末端的19个核苷酸作为潜在siRNA目标部位进行了记录。 潜在靶位通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除与其他基因明显相同的靶位。 如果可能，siRNA必须基于mRNA低的二级结构的区域来设计。 2 .低GC含量的siRNA Ambion公司的研究表明，GC含量为40-55%的siRNA比55%以上的活性高。 3 .纯化体外转录siRNA在转染前必须确认siRNA的大小和纯度。 为了得到高纯度的siRNA，用玻璃纤维结合，溶出(Ambion siRNA体外合成试剂盒中包含纯化柱，保证siRNA纯度)，或用15-20%丙烯酰胺除去反应中多馀的核苷酸、小寡核苷酸、蛋白和氯离子注意：化学合成的RNA通常需要运行凝胶电泳纯化(即PAGE凝胶纯化)。 4.RNA酶不污染微量的RNA酶在siRNA实验中失败。 由于RNA酶普遍存在于实验环境中，比如皮肤、头发、徒手接触或暴露于空气中保证实验的每一步都不被RNA酶污染是非常重要的。 Ambion公司在这方面，拥有去除RNA酶的喷雾剂、纸张和液体剂、RNA酶的检测和去除等一系列生产线。 5 .通过健康的细胞培养物和严格的操作确保转染再现性，通常健康的细胞转染效率高。 另外，低传递代数确保了每次实验中使用的细胞的稳定性。 为了优化实验，推荐50多岁以下的转染细胞。 否则，细胞转染效率会随时间显着下降。 6 .避免应用抗生素Ambion公司建议，从细胞栽培到转染后72小时内，避免使用抗生素。 抗生素在透过的细胞中积蓄毒素。 部分细胞和转染试剂在转染siRNA时需要没有血清的条件。 此时，将正常培养基和无血清培养基并用进行比较实验，可以得到最佳转染效果。 QIAGEN发表的转染RNA专用试剂7 .选择好的转染试剂将siRNA转染目标细胞类型，选择好的转染试剂和最佳操作对siRNA实验的成功至关重要。 siRNA实验要求选择适合小RNA的转染试剂(现在，很多转染试剂转染较大的质粒DNA，不是小的RNA分子，宿主范围的大小也不同)。 Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit和QIAGEN公司的transmessengertransfectionreason是siRNA优化的转染试剂，是理想的选择。 8 .通过适当的阳性对照来优化转染和检测条件对许多细胞来说，留守基因是较好的阳性对照。 将不同浓度阳性对照的siRNA转移到靶细胞(适用于同一实验靶siRNA )，转染后48小时后统计对照蛋白质或mRNA对未转染细胞的降低水平。 siRNA过多会导致细胞毒性和死亡。 Ambion