《合成生物学》课件.ppt

1、合成生物学(Synthetic biology)(概念、原理、应用),马飞,人工染色体(技术),BAC(细菌人工染色体)：Bacteria 以细菌作为对象，将DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖 YAC(酵母人工染色体)：Yeast 以酵母作为对象 PAC(噬菌体人工染色体)：Phagemid 以噬菌体作为对象 TAC(可转化的细菌人工染色体) MAC(哺乳类人工染色体) ,合成生物学应运而生,Synthetic Biology,What is Synthetic Biology?,Taking an engineering approach to design and applying it

2、 to Biology 使用工程策略设计并应用于生物学,What is Synthetic Biology? 1. Biology 2. Chemistry 3. Engineering 4. Re-Writing,Biologists Chemists Engineers “Re-Writers”,“The code is 3.6 billion years old. Its time for a re-write.” -Tom Knight,Biology “Test models by building them”,合成生物学,指人们将“基因”连接成网络，让细胞来完成设计人员设想的各种任

3、务。 例如把网络同简单的细胞相结合，可提高生物传感性，帮助检查人员确定地雷或生物武器的位置。 再如向网络加入人体细胞，可以制成用于器官移植的完整器官。,人工合成脊髓灰白质炎病毒cDNA,美国纽约大学Wimmer 实验室于2002年报道了化学合成 脊髓灰白质炎病毒cDNA，并用RNA聚合酶将它转 成有感染活力的病毒RNA。 开辟了利用已知基因组序列，不需要天然模板，从化合物单体合成感染性病毒的先河。,Wimmer从装配平均长度为69 bp的寡核苷酸入手，结合了化学合成与无细胞体系的从头合成，用了3 年时间完成了这个划时代的工作。,Venter 实验室发展了合成基因组, X-174 噬菌体基因是单

4、链环状 DNA，是历史上第一个被纯化的DNA 分子，也是第一个被测序的DNA分子。 X- 174 噬菌体对动植物无害，是合适的合成研究对象。 美国Venter 实验室发展了合成基因组的工作， 该实验室只用两周就合成了 X-174 噬菌体基因 (5,386bp) 。 Venter实验室的技术改进主要有： (1)用凝胶来提纯寡核苷酸以减少污染； (2) 严格控制退火连接温度来防止与不正确的序列发生连 接； (3)采用聚合酶循环装置来装配连结产物。,合成生物学国际会议,2004 年6 月在美国麻省理工学院举行了第一届 合成生物学国际会议。 会上除讨论了科学与技术问 题外，还讨论了合成生物学当前与将来

5、的生物学风险，有关伦理学问题，以及知识产权问题。 随着这个领域的发展，对于合成生物学的安全性的考虑愈来愈多。 现在不仅通过合成生成病毒，而且已经可以合成细菌。,合成生物学开辟了设计生命的前景,一方面有可能合成模仿生命物质特点的人工化学系统；另一方面也可能重新设计微生物 如Keasling 实验室向大肠杆菌中导入青蒿与酵母的基因，使大肠杆菌能在调节下合成青蒿素，从而显示了有效而价廉的治疗疟疾的前景 合成生物学今后将能生成自然界不存在的新的微生物。,应用示例,Schultz 实验室研究向大肠杆菌蛋白质生物合成装置中添入新组份，使之能通过基因生成非天然的氨基酸，结果取得了成功。但是要在真核细胞做到这

6、一点还有难度。 2003年，Schultz 实验室报道了一种向酵母加 入非天然氨基酸密码子的方法，成功地向蛋白质中导入了5 种氨基酸。 目前，能掺入到蛋白质的非天然氨基酸已有80多种。 今后将可以直接向蛋白质导入顺磁标记、金属结合、光敏异构化等的氨基酸，促进蛋白质结构与功能的研究。,应用示例,Brenner 提出向细胞DNA中掺入天然不存在的碱基来发展人工遗传系统, 支持人工生命形式。 合成生物学也将对生命起源，其他生命形式的研究作出贡献。,控制生命,目前，研究人员正在试图控制细胞的行为，研制不同的基因线路即特别设计的、相互影响的基因。 波士顿大学生物医学工程师科林斯已研制出一种“套环开关”，

7、所选择的细胞功能可随意开关。 加州大学生物学和物理学教授埃罗维茨等人研究出另外一种线路： 当某种特殊蛋白质含量发生变化时，细胞能在发光状态和非发光状态之间转换，起到有机振荡器的作用，打开了利用生物分子进行计算的大门。,维斯和加州理工学院化学工程师阿诺尔一起，采用“定向进化”的方法，精细调整研制线路，将基因网络插入细胞内，有选择性地促进细胞生长。,发展方向,维斯目前正在研究另外一群称为“规则系统”的基因，他希望细菌能估计刺激物的距离，并根据距离的改变做出反应。 该项研究可用来探测地雷位置(TNT：生物传感器)。,维斯另一项大胆的计划是为成年干细胞编程 促进某些干细胞分裂成骨细胞、肌肉细胞或软骨细

8、胞等，让细胞去修补受损的心脏或生产出合成膝关节。 尽管该工作尚处初级阶段，但却是生物学调控领域中重要的进展。,J. Craig Venter：基因组替换,成功利用基因组取代技术，将一种细菌改变为另一种与之亲缘关系较为紧密的另一细菌。这种由J. Craig Venter 进行的 “移植(transplantation)”技术，有望将合成基因组插入细胞，用于生产合成生命。 用Mycoplasma mycoides的基因组取代与之关系密切的 Mycoplasma capricolum的基因组 C. Lartigue et al. Genome transplantation in bacteria:

9、 Changing one species to another Science, June 28, 2007.,人类历史上第一个人造染色体合成成功,美科学家称“人造生命”技术已被掌握 最具争议的美国著名科学家克雷格文特尔宣布，他的研究小组已经合成出人类历史上首个人造染色体，并有可能创造出首个永久性生命形式，以此作为应对疾病和全球变暖的潜在手段。 该研究部分由美国能源部出资，希望藉此研制出新型环保燃料。由文特尔召集，诺贝尔医学奖获得者汉密尔顿史密斯领导的研究小组在这方面已经进行了5年研究。 文特尔已用化学药品在实验室中研制出一种合成染色体。,文特尔研究小组研制出的这种新型染色体即实验室合成支原

10、体(Mycoplasma laboratorium)，是一种经过简化拼接的生殖支原体(Mycoplasma genitalium)DNA序列，他们将这种合成支原体移植到活细胞中，使之在细胞中起主控作用，变换成一种新的染色体。 按照实验计划，最终这个染色体将控制这个细胞并变成一个新的生命形式。 这种新单细胞生物体被命名为“合成器”，受381个基因控制，包含56万个碱基对。这些基因是维持细菌生命所必备的，使它能够摄食和繁殖。由于新的生物体是在现存生物体上搭建，其繁殖和新陈代谢仍然依赖原来生物体的胞内机制。 从这一角度看，它并非完全意义上的新型生命形式。但这种给特定基因赋予特定任务的观点已被众多生物

11、学家广泛接受。,“这是人类自然科学史上一次重大进步，显示人类正在从阅读基因密码走向有能力重新编写密码，这将赋予科学家新的能力，从事以前从未做过的研究。” 他希望这项突破有助于发展新能源，应对气候变化造成的负面影响。如创造出具有特殊功能的新微生物，可被用作替代石油和煤炭的绿色燃料，或用来帮助清除危险化学物质或辐射等；还可用来合成能吸收过多二氧化碳的细菌，为解决气候变暖贡献力量。,然而制造永久生命形式的前景极具争议性，有可能激起道德、伦理等方面的激烈辩论。 加拿大生物伦理学组织ETC团体主任帕特穆尼说，文特尔制造出了“一个基架，在此基架上人们几乎可以制造出任何东西”，“它可以用于研究新型药物，也可

12、以用于对人类产生巨大威胁的生物武器”。,2009：Venter：Science,把蕈状支原体的基因组加以改造，使它能够终移植到山羊支原体内，形成了一个新的蕈状支原体细胞。 这也是今年这篇科研论文的雏形，在国外的科学媒体上曾经引发热烈的讨论。,2010年的重要大事：“人造生命”诞生,John Craig Venter搅乱了(生命)科学界,用化学合成的基因组构建一个细菌细胞,Venter的实验http:/www.science-,实验对象：蕈状支原体。 支原体是已知的可以自由生活的最小生物,也是最小的原核细胞。 是一种原核微生物, 内部结构很简单，基因组仅有一百多万碱基对，远小于真核生物基因组十亿

13、级的碱基数量，这也是Venter选择操作它的原因。 Venter早在1995年就对生殖支原体测序，并致力于研究维持自由生命的最小基因组。 在2008年，Venter的团队合成了长达59万碱基对的生殖支原体基因组。 此后，他们选择生长速度更快的蕈状支原体来做实验。 如果仅仅从技术上来说，Venter做了一个无懈可击的实验，“人造生命”思路和流程都做得无懈可击。,三个步骤：合成、组装和移植,合成 ： 蕈状支原体的基因组是一条大片段的DNA分子，序列是A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸的排列组合。 通过实验确定维持其生命周期的最小基因组，并加上4个“水印基因”作为标记。 用计算机精确计算需要合成DNA

14、分子序列，并用化学方法合成A、T、G、C碱基，并使其按所要求序列延伸。 这是它被称为“人造生命”或者“化学合成”的关键。 Venter用化学方法合成了一千多个约1kb的DNA片段，作为这次组装的基本材料。,组装： 因为合成生物学技术上的局限，不能直接合成上万碱基对的DNA大分子，所以Venter等人巧妙地借助啤酒酵母和大肠杆菌的帮助，把1Kb的DNA分子有序准确的连成超过1000kb的片段。 移植： Venter等把这个合成基因组移植到不含限制性酶切系统的山羊支原体中，基因组能使用后者的酶系统进行自我复制，经过多代繁殖后，长成的菌落已经纯粹由蕈状支原体组成。,Venter：“创造了一个计算机为

15、父母的生命”,JCVI：将8个由60个核苷酸组成的DNA片段，首次人工合成实验老鼠的线粒体基因组,使用8个只含有60个核苷酸的DNA片段，让它们同酶和化学试剂的混合物相结合，在50下孵化1小时，5天内合成出了实验鼠的线粒体基因组，得到的基因组能够纠正具有线粒体缺陷的细胞内的异常。,用途：生物能源、生物除污,Venter下一步的计划就是合成某种海藻基因组，这种新型海藻可以通过光合作用把空气中的二氧化碳转化成汽油或者柴油等清洁能源，从而有效解决目前的气候变化和能源危机。 疫苗、药物、生物能源、生物除污等,What is Synthetic Biology?,从原理角度来看,Synthetic Bi

16、ology,Undergraduates in Synthetic Bio.,international Genetically Engineered Machines,/registry/index.php/Main_Page,Lego Assembly for DNA Parts,/registry/index.php/Assembly:Standard_assembly,Self-organized Pattern Formation,What can you make in SB?,Arsenic Detect

17、or,脓毒症,砷,Modifying life,Biotechnology Techniques that use living organisms or parts of organisms to produce a variety of products (from medicines to industrial enzymes) Genetic Engineering Introduction of genetic changes (add, modify, delete) into an organism to achieve some goal Synthetic Biology C

18、reate novel biological functions and tools by modifying or integrating well-characterized biological components (i.e. genes, promoters) into higher order genetic networks,Synthetic Biology History,1970 First gene synthesized from scratch (alanine tRNA) 1978 Nobel prize awarded to Werner Arber, Danie

19、l Nathans and Hamilton Smith for the discovery of restriction enzymes 1978 (Boyer at UCSF) A synthetic version of the human insulin gene was constructed and inserted into the bacterium E. coli. 1980 Kary Mullis invents PCR 1991 Affymetrix chip-based oligonucleotide synthesis 2003 First iGEM competit

20、ion, creation of standardized parts libraries at MIT,Biotechnology 1.0 Research Workflow,1. Concept,2. Collect DNA fragments (PCR, isolation, vendors, etc),6. Transform,7. Test,3. Bench work,5. Verify DNA,4. Sequence,DNA synthesis costs are dropping,For example the bacteria Mycoplasma genitalium has

21、 the smallest genome out of all living cells: 517 genes over 580 kb. Minimal costs of oligo creation (not including error-checking): Mid 1990s: $1/bp = $580,000 Circa 2000: $0.35/bp = $203,000 2006: $0.11/bp = $63,800 Ambitious prediction of not-too-distant future (Church et al, 2004): $0.00005/bp =

22、 $29,Synthesis lengths are increasing,Commercial DNA Synthesis Companies,Data Source: Rob Carlson, U of W, Seattle,Bioneer South Korea,Cinnagen Tehran, Iran,Takara Biosciences Dalian, China,Inqaba Biotec Pretoria, South Africa,Fermentas Vilnius, Lithuania,Bio S DNA breaks Adaptation: Fix it! Side be

23、nefit: extreme radiation resistance D. Radiodurans: incredible resistance,Other extremophiles,Desert Varnish exists in the driest places on Earth Varnish includes bacteria that: Arrange clay and manganese above them to shield them from the elements; oxidize Mn to produce ATP Are great for showing wh

24、ere pollutants in water exist or where off-road vehicles stir up alkaline dust.,Lichens a symbiosis of fungi and algae Dry out completely and photosynthesize only when wet The first step in creating soil out of rock (e.g., Sierra Nevada: polished by glaciers 12 kyr ago, heavily wooded now.) Edible!

25、(Manna?),Xerophiles,Piezophiles organisms that live at high pressure(高气压) Pressure increases by 1 atm (= 15 pounds per square inch) every 10 meters in water, or every 5 meters in rock. Benefit: Water is liquid for a higher range of temperatures as the pressure goes up this allows liquid water to ten

26、s of kilometers depth T goes up 25 C per km in crustso 121 C = about 4 km Problem: Pressure changes the packing of DNA and membrane lipids Problem: Pressure inhibits reactions that lower the density (more products than reactants) Adaptation: ? Life in Vacuum 1964: Surveyor 3 camera in space for 2.6

27、years, unprotected. On returning from the Moon, viable streptococcus bacteria are cultured from it!,More extremophiles,Longevity Viable microbes from ice cores (Lake Vostok) up to 20 Myr From bee abdomens in amber 25 Myr From salt in salt mines many Myr (controversial) Multicellular extremophiles? T

28、artigrades (water bears): in a dry (tun) state, can withstand temperatures up to 151 C, X-rays, vacuum, and pressures of 6000 atmospheres. Life without light? Autolithotrophic communities: (SLiMe) Basalt rock & water: has C,N,O,H, S just need energy Energy from oxidation of S & H and reduction of S

29、and nitrates. Note: life had to be like this before photosynthesis was invented.,More amazing life,Summary,Creating biological circuits may teach us as much about life as trying to reverse-engineer them (learn by doing) The keys to SB are abstraction, isolation of design & fabrication principles and

30、 modularity,Synthetic Biology,Sergio Peisajovich Lim Lab June 2007,Synthetic Biology,What is Synthetic Biology?,It is an emerging field of biology that aims at designing and building novel biological systems.,The final goal is to be able to design biological systems in the same way engineers design

31、electronic or mechanical systems.,Why do we need it?,“What I cannot create, I do not understand.” - Richard Feynman,无法创造的东西，我无法理解只有通过创造才能理解。不能理解的东西，我无法创造。 What I cannot create I do not understand. 美国物理学家理查德费曼,Synthetic Biology,Why do we need it?,Cells are the ultimate Chemical Factory.,Synthetic Bio

32、logy,1- Biology is hierarchical,Is it achievable?,Synthetic Biology,2- Biology is Modular,Is it achievable?,Synthetic Biology,Hierarchy and Modular (recurrent) organization allows biology to be understandable and synthetic biology to be possible.,Is it achievable?,Synthetic Biology,A possible hierar

33、chy for synthetic biology,Synthetic Biology,Biological Components: 1-Parts,Synthetic Biology,Biological Components: 2-Devices,Synthetic Biology,Biological Components: 3-Systems or Modules,Synthetic Biology,Biological Components: 3-Systems or Modules,Basu et al (2005) Nature, 434: 1130-4,Synthetic Bi

34、ology,Biological Components: 3-Systems or Modules,Synthetic Biology,Biological Components: 3-Systems or Modules,Synthetic Biology,For synthetic biology to become a form of engineering it will be necessary to achieve precision and reliability. Factors preventing this: 1- Incomplete knowledge of biolo

35、gy. 2- Inherent functional overlap (parts with many -some unknown- functions, some of which are detrimental to the goal in mind. 3- Incompatibility between parts. 4- Parts functionality depends on context.,Synthetic Biology as Engineering,2- CI represses expression of unrelated host genes,3- LuxR in

36、teracts with CI and blocks its function,4- GFP is non-fluorescent in host,Synthetic Biology,Synthetic Biology as Engineering,Standard Parts,Parts should not have multiple functions (One subunit of T7 phage DNA polymerase is actually E. coli thioredoxin),Parts should not encode multiple functions,Syn

37、thetic Biology,Synthetic Biology as Engineering,Standard Parts,Different parts should be compatible,Parts should work in different contexts,Synthetic Biology,Synthetic Biology as Engineering,Standard Parts,Standardized parts could be easily exchanged between different devices (as well as between dif

38、ferent laboratories),Synthetic Biology,Synthetic Biology as Engineering,Abstraction,DNA TGCATGCTGATATACGGCTCGAT,Parts,Devices,Systems,Yeast & Cloning,Sergio Peisajovich Lim Lab June 2007,Experimental Lab,Why Yeast?,The yeast Saccharomyces cerevisiae (also called “bakers yeast”) is probably the ideal

39、 eukaryotic microorganism for biological studies. Yeast genome: fully sequenced and easy to manipulate. Basic mechanisms of yeast cell biology (such as DNA replication, recombination, cell division and metabolism) are highly similar to that of higher organisms (including humans).,Experimental Lab,Ye

40、ast Life Cycle,Experimental Lab,Yeast: Ideal Platform for Synthetic Biology,Add parts, devices or even modules (in an “extra-genomic” format -plasmid-based- or “integrating” them within the yeast genome. Delete specific yeast genes, to remove “background” or interference. Add “reporter genes” to mon

41、itor in real time the function of the synthetic parts/devices/modules under study. Life cycle fast enough so that we could do all these genetic manipulations in a reasonable amount of time.,Experimental Lab,Yeast: Adding parts in plasmids,Experimental Lab,Yeast: Adding parts in plasmids,growth in se

42、lective medium,Experimental Lab,Yeast: Adding parts into the genome,Homologous recombination allows genomic integration, but we still need to select:,Experimental Lab,Yeast: Adding parts into the genome,Part/Device/Module,URA3,plasmid,Digest with specific restriction enzyme,Part/Device/Module,plasmi

43、d,Linear DNA, ready for yeast transformation and integration,Part/Device/Module,URA3*,Homologous Recombination,Yeast Chromosome,Incoming Linear DNA,URA3*,URA3,Part/Device/Module,Integration (Note that 2 copies, one defective and one functional, of the marker are generated),Yeast Chromosome,Experimen

44、tal Lab,Yeast: Adding parts into the genome,URA3,plasmid,URA3,PCR product,Linear DNA, ready for yeast transformation and integration,yfg,Homologous Recombination,Yeast Chromosome,URA3,Integration (yfg is now disrupted),Yeast Chromosome,URA3,Experimental Lab,Combinatorial Cloning,A,B,B,C,C,D,A,D,A,D,

45、Experimental Lab,Combinatorial Cloning,Based on Type IIs restriction enzymes,Combinatorial Cloning,Experimental Lab,Combinatorial Libraries,Experimental Lab,Synthetic Biology as Engineering,Engineering Negative Feedback Loops,Negative Effectors to be used: OspF (MAPK Phosphothreonine Lyase) YopJ (MA

46、PKK Ser/Thr acetylase) YopH (MAPK Tyr phosphatase) Promoters to be used: Constitutive expression (Adhp, CycIp, Ste5p) Inducible by pathway activation (STLp, Fig1p) Protein-interaction domains: Leucine Zippers (high and medium affinities, some with degradation motif),Prom,Tag,Effector,Zipper,Term,Exp

47、erimental Lab,Synthetic Biology as Engineering,Engineering Negative Feedback Loops,1- Combinatorial Cloning in Bacteria 2- Transfer Constructs into Yeast 3- Analyze Pathway Behavior,Experimental Lab,Synthetic Biology as Engineering,Engineering Negative Feedback Loops,1- Combinatorial Cloning in Bact

48、eria DONORSACCEPTORS,Prom,Tag,Effector,Zipper,Term,Experimental Lab,Synthetic Biology as Engineering,Engineering Negative Feedback Loops,1- Combinatorial Cloning in Bacteria,Experimental Lab,Synthetic Biology as Engineering,Engineering Negative Feedback Loops,2- Transfer Constructs into Yeast 3- Ana

49、lyze Pathway Behavior FACS Microscopy,基因未来可能成标准件 新物种将像电脑般被组装,将一个青蒿基因植入大肠杆菌，改造后的大肠杆菌制造出一种中间化合物，这种化合物经过数步处理就能成为青蒿素的原料-青蒿酸。 把一种特殊的酶植入酵母后，酵母把前面提到的中间化合物改造成了青蒿酸。 可以说，通过微生物工业生产青蒿素的技术链条已经基本成形，只剩下最后一层窗户纸了。 意味着青蒿素的价格将下降90%，意味着更多的人将可能活下来,克隆羊多利的诞生,胚胎羊,乳腺上皮细胞 (提供DNA),母羊,除去细胞核的卵母细胞(受体),体外融合,植入受体母羊,首个人造物种问世 意义将超过克

50、隆羊,文特尔在破解人类基因组的计划中起了重要作用 “人造物种”对大部分人来说还是一个陌生的概念，但在生物学界已经是炙手可热的新型研究领域。 曾在破解人类基因组计划中起到重要作用的美国科学家克雷格文特尔再次走到了前列。,能吃CO2的细菌,采用合成生物学的办法将携带特定遗传密码的DNA片段合成最小、最简单的基因组，并将该基因组植入已经去掉遗传密码的细菌体内，形成新的微生物，然后观察它们是否能激活，进行新陈代谢和繁殖。 这种细菌能吸收二氧化碳，减轻温室效应，还能产生氢气和生物能源。,将遗传因子植入大肠杆菌进行摄影,美国加州大学旧金山分校和得克萨斯大学的研究者成功地利用转基因大肠杆菌拍摄了研究小组成员

51、的肖像。 这是在合成生物学领域人类所取得的一个新的成果。 大肠杆菌是一种容易引起食物中毒的细菌，但经过转基因处理，它却具有了与照相机的胶卷几乎一样的成像本领。 旧金山分校29岁的克里斯.博伊特是本次研究的主要带头人。,他的研究小组将经过光的反应可以释放出黑色化合物的海藻的遗传基因采集下来，植入大量的大肠杆菌之中。 然后再将这些被植入了遗传因子的大肠杆菌放入一个培养器皿中，送入培养器中进行培养。 之后，从培养器的上面，用功力很强的投影仪将研究小组成员的画像投影上去，使细菌的一部分感光。 结果，“拍摄”下来研究小组的画像就像从前的黑白照片一样，虽然有些朦胧，当人样子还是出来了。 博伊特说，像素大约

52、为100万，可达高性能打印机的十倍。,Do-It-Yourself Biology,Synthetic Biologist Drew Endy: Programming Living Systems,微软公司涉足合成生物学,获得首笔资助的研究人员来自加拿大的英属哥伦比亚大学和美国的哈佛大学、约翰霍普金斯大学、加州理工学院等 他们的研究方向包括研制下一代的克隆方法、创建让DNA 折叠成更复杂形状的计算机密码、使用可设计编程的层叠键，让DNA 折叠变得更大、更复杂，并具有结构重建的特性。,合成生物学国际基因工程机器设计大赛研讨会在天津大学召开,2007年4月16日-17日，合成生物学与国际基因工程

53、机器设计大赛(international Genetically Engineered Machine competition简称iGEM)研讨会在天津大学召开。 合成生物学作为一门迅速成长的新生学科，一经兴起便引起了世界知名学府的广泛关注，M.I.T.于2003年基于合成生物学的思想发起了iGEM大赛，并将其在2005年迅速升级为世界范围的比赛。哈佛，剑桥，普林斯顿无不对此表现出极大热衷，参赛者充分发挥自己的创意，用生物系统中的基本组件(基因，蛋白质等)合成出具有某些特定生物学功能的基因电路。 已有不少经典案例如生物底片，生物传感器等体现了合成生物学的最高水平或者成功应用于解决环境健康等国际问题。,北京大学代表队获得iGEM比赛唯一大奖