生物技术知识总结与复习题

1、 亲爱的，加油哦！俺家叫兽保佑，逢考必过哦！一 基因工程的基本步骤：n （1）分离：提取和获得目的基因和载体DNA；n （2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切；n （3）连接：目的基因与载体连接，形成新的重组 DNA分子；n （4）转化：用重组DNA分子转化受体细胞；n （5）筛选：能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定；n （6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。二 常用工具酶:n 型核酸内切限制酶: 基因工程说到的限制酶是型酶，具有此类酶的微生物限制修饰系统分别由限制酶和甲基化酶来完成。型酶分子量小，仅需Mg2作为催化反应的辅因子

2、，识别与切割位点相同 (1.识别核苷酸序列，大多有回文结构n 2. 具有特定的酶切位点) 在其识别位点之中或邻近的确定位点特异地切开DNA链,产生特异的DNA片段,是I II III类中唯一用于DNA分析和克隆的一类.有一些限制酶的识别序列是不对称的,有一些限制酶可识别多种序列.限制酶识别序列的长度一般为48个碱基,最常见的为6个碱基. (、型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段)限制酶产生的末端: 粘性末端：产生的 DNA片段末端的一条链多出一至几个核苷酸。3端比5端长的称为3粘性末端，5端比3端长的称为5粘性末端。 平末端：产生的DNA片段末端是平

3、齐的. 同裂酶：来源不同但具有相同的识别序列的限制性内切酶被称为同裂酶,产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶：来源不同、识别序列也不同，但产生相同的黏性末端，叫同尾酶。 由同尾酶产生的DNA片段是能够通过碱基互补彼此连接起来，但重组后的片段不能被前述两种酶中的任何一种所识别。限制酶的用途n 1 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制片断n 2.建立限制酶（物理）图谱绘制n 3.构建基因文库n 4.用限制酶切出相同的粘性末端，以便重组命名（1973年Smith 原则、型酶） 根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。 第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母 第二、三个字母小写 该微生物种名

4、前的2个字母 第四个字母大写 有变种或株系的第一个字母 罗马字母、 从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列 如Eco R是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。n DNA聚合酶(从DNA的5端起始开始复制到3端的酶):共同点是：它们都能够把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。n 常用的聚合酶有：1大肠杆菌DNA聚合酶（E.coli DNA聚合酶，Pol）: 基本酶活性： 53的DNA聚合酶活性， 53的核酸外切酶活性， 35的核酸外切酶活性。发挥生物学活性的条件： DNA 模

5、板（可以是单链或双链），带有3-端游离羟基的引物链，底物和激活剂用途：用缺口平移方法标记DNA；对带有3突出端的DNA分子进行末端标记；补平或标记限制性内切酶消化后产生的3凹端；2大肠杆菌DNA聚合酶的大片段（Klenow酶）:性质：经过枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶，或用基因工程手段去除全酶中的53的核酸外切酶活性片段，而还具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性的全酶大片段. 主要用途：标记DNA片段的末端,在无底物时只进行3 5外切；有底物存在时则聚合。3 T4DNA聚合酶: 具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,但其35的核酸外切酶活性比Klenow酶强近20

6、0倍,无5到3外切酶活性.用途：对带有3突出端的DNA分子进行末端标记；补平或标记限制性内切酶消化后产生的3凹端；将双链DNA的末端消化成平末端，这是其强劲的35的核酸外切酶活性才能做到的。4 耐热DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）:显著特点是热稳定性. 应用：（1）DNA 序列测定（2）PCR (polymerase chain reaction)对DNA 的特定片段进行体外扩增。如：TaqDNA聚合酶能在72条件下以单链DNA为模板按53方向合成新生互补链5 末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）: 性质：使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸产生黏性末端。主要用途：分别给外源DNA

7、片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以便使外源DNA 与载体连接。n 甲基化酶:用于保护宿DNA不被切割,甲基化酶可以用来改变内切酶的识别特异性,且这种特异性的改变具有专一性.三 其它工具酶n DNA连接酶: 催化机理：催化双链DNA片段紧靠在一起的3OH末端与5 P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。常用的连接酶：E.coli DNA 连接酶：只能连接具有黏性末端的DNA片段 ，由NAD+供能。T4 DNA 连接酶：连接黏性末端、平末端的DNA片段 ， 由ATP供能.作用:能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子n 反转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶):以RNA

8、链为模版聚合cDNA链.基本特性:双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链.n 依赖于DNA的RNA聚合酶:即转录中的合成酶,以DNA链为模版合成RNA.无需引物,但需识别特异性位点.n 核酸酶:内切酶: 切核酸分子内部切割磷酸二酯键 .外切酶:切核酸分子的末端切割磷酸二酯键 n T4多核苷酸激酶:一种磷酸化酶,可将ATP的r-磷酸基团转移至DNA或RNA的5末端. 使DNA或RNA分子5-OH末端磷酸化n S1核酸酶(单链核苷酸外切酶):切割带缺口或缺刻的双链DNA或RNA.主要用途: 去除DNA片段的单链突出端，使之成为平末端 去除cDNA合成时的发夹环结构 n 碱性磷酸酶: 可催化去除D

9、NA或RNA的5磷酸的反应.四 基因工程载体(老师说理解常用的两种质粒载体,结合后面的重组子的筛选和检测来记):n 载体应具备的条件: 在载体细胞能自我复制，有复制原点,具有一种或多种限制酶的单个酶切位点,有容易被识别筛选的标记基因,克隆载体必须是安全的,容易进入宿主细胞，而且进入效率高；载体分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作；n 最常用的载体：质粒、噬菌体、柯斯质粒n 作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件： （1）能自主复制；（2）具有一种或多种限制酶的单一酶切位点，并在此位点插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有12个筛选标记，为宿主提供易于检测的表型特征；（4

10、）分子量小，多拷贝，易于操作n PBR322质粒: 两种抗性选择标记基因,多种限制酶的单个切点 ,利用限制酶切点上插入外源DNA使抗性基因失活,可通过插入失活进行筛选 n pBR322质粒载体的优点：具有较小的分子量。4363bp,可用于克隆10kb以下的外源DNA。具有两种抗生素抗性基因可供做选择记号，氨卡青霉素抗性基因apr/ampr上有3个酶切位点，tet/tcr上有7个酶切位点。具有较高的拷贝数n PUC系列载体: 分子量小，但可以接受较大的外源片段；拷贝数多；多克隆位点的酶切位点多，克隆方便；具有-互补显色表型，可作为检测重组质粒存在与否的选择标记五 补充: 噬菌体载体的构建: 缩短

11、野生型DNA的长度，可以提高装载量。噬菌体长度约为48kb，包装范围为1530kb。只在非必须区保留12个识别序列。保留一个可供外源基因插入（插入型载体）；若保留两个，则两个识别序列之间的区域可被外源DNA置换（置换型载体）。为了克服噬菌体无筛选标志的缺陷，一般把质粒的筛选标记基因插入到噬菌体DNA的合适区域。n 柯斯质粒特点：具有噬菌体的特性：可以高效导入噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞,具有质粒载体的特性：能在寄主细胞内进行复制,具有高容量的克隆能力：克隆能力为31.446kb.六 判断是否有回文结构 1 是否有对称轴2 对称轴两侧距离相等的碱基可互补配对3阅读顺序一致,按3到5读和按5到3读

12、的结果相同.七 PCR技术:反应成分包括:1一对寡核苷酸引物2 具有热稳定性的酶 3 Dntp 4 作为模版的目的DNA序列. PCR反应过程:1变性 2退火 3延伸(聚合酶作用下互补的原则在引物3端加单核苷酸)第二章 基因工程 下1.目的基因的获取方法：从生物基因组中直接分离目的DNA鸟枪法（即用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别与载体相连，然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的所有DNA片段分别在各个细胞中大量复制，并通过一定的方法把目的DNA片段从细胞中分离出来）：供体细胞中的DNA 酶切 载入运载体 转入不同的受体细胞 所有片段在各个受体细胞大量复制

13、目的基因的DNA片段分离。人工合成目的DNA片段（两种途径）：A.以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。B.根据已知的蛋白质的氨基酸序列推测出相应的mRNA序列，然后按碱基互补配对原则，推测出其结构基因的核苷酸序列，再通过化学的方法，以单核苷酸为原料合成目的基因，若目的基因全序列已知，则可利用化学合成法直接合成。PCR技术获取目的基因：A.此种方法的应用前提：必须知道目的基因的全序列或者其两侧的序列。B.PCR的反应成分包括：一对寡核苷酸引物、具有热稳定性的酶、dNTP、作为模板的目的DNA序列。C.PCR反应过程（变

14、性、退火、延伸）：模板双链DNA 加热变性（9395度） 单链DNA 降温复性（5070度） 引物与模板结合 延伸（6572度） 聚合酶作用下根据碱基互补配对原则在引物的3端加单核苷酸，形成2个DNA分子进入第二个循环。2.一般目的基因与载体是用同种酶切的，如果用两种不同的限制酶同时切割某一种特定的DNA分子，将会同时出现具有两种不同黏性末端的DNA片段。3.不同目的基因尾端的连接：大肠杆菌DNA连接酶可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。A平末端的连接：可直接用T4DNA连接酶将具平末端的DNA片段连接起来；同聚物加尾法连接，即用末端脱氧核苷酸转移酶给

15、具平末端的DNA片段加上poly（dA）- poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。B黏性末端的连接：互补黏性末端：可直接用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；非互补黏性末端：先用S1核酸酶处理变成平末端后，再用同聚物加尾技术或在末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成互补粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。4.实现基因转移（重组DNA分子导入受体细胞）的方法：A.转化和转染（主要用于细菌）：转化是指以质粒为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞的过程，包括制备感受态细胞和转化处理。转染是指以噬菌体为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞的过程。无论转化还是转

16、染，其关键都在于用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，使外源DNA分子更易进入。B.转导（主要用于构建基因文库和动植物的转基因）：是指具有感染能力的噬菌体颗粒或者重组的柯斯质粒载体感染宿主细胞，而将外源基因转入受体细胞的过程。C.显微注射法（用于制备转基因动物）。D高压电穿孔法（电融合）（用于微生物细胞和动植物悬浮细胞或原生质体的基因转化）。E.基因枪法，花粉管通道法，子房、胚囊注射法。5.重组子的筛选：A.根据载体的遗传标记基因筛选（即遗传检测法）：包括抗药性筛选法和-半乳糖苷酶显色反应选择法，常用的有互补、抗生素基因等。B.根据报告基因筛选：报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基

17、因，其表达产物应便于检测与定量分析，主要有抗生素类、除草剂类、荧光类。应将报告基因与目的基因组装后再导入受体细胞，若能检测出报告基因，就能说明目的基因也存在于受体细胞内。C.根据形成的噬菌斑筛选。6.蓝白斑筛选：是根据载体的遗传特征筛选重组子的一种方法。许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息，在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺

18、少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-gal存在时可产生蓝色菌落，易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，改变了-半乳糖苷酶的氨基端并影响其功能，由此丧失-互补能力，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过颜色不同可区分重组子与非重组子，这种重组子的筛选称为蓝白斑筛选。7.pUC18载体的使用：pUC18带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列，在这个编码区中插有一个多克隆位点，且不影响正常功能，DH5感受态菌株带有-

19、半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息，当pUC18载体在正常情况下同感受态菌株融合后，互补表达具有酶活性的蛋白质，称为-互补现象，当有外源片段插入多克隆位点后，互补现象消失，其形成的菌株颜色具有很大的差异，很容易鉴别，这种筛选方法称为-互补现象筛选。pUC18载体除了能重组导入外源片段外，在筛选表达过程中也具有重要的作用。8.重组子的检测：A.根据重组子DNA分子特征检测：根据重组DNA分子的大小鉴定重组子（重组DNA分子量大，电泳时迁移得慢，泳带滞后）。限制酶切重组DNA分子鉴定重组子（根据已知外源DNA序列的限制酶切图谱选择酶切后，经过电泳比较电泳结果：DNA带数与长度）。利用PCR扩增来筛

20、选重组子（过程：从重组克隆中提取质粒或DNA；用外源DNA插入片段作PCR引物；电泳PCR引物；检查是否有PCR产物；比较PCR产物的长度是否与外源基因一致）。探针杂交：探针是指一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。菌落原位杂交是指将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交。DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。作为探针的核酸序列应具备以下两个条件：应是单链，若为双链，必须先行变性处理。应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA

21、本身，也可以是由之转录而来的RNA。B.根据目的基因表达产物检测:生物学活性检测法（蛋白质生物功能测定法）:基因表达功能蛋白，再用选择培养基平板法。放射免疫原位检测法：原位杂交+免疫组织化学。蛋白质凝胶电泳检测法。第三章 细胞工程1、 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒诱导法）、化学方法（PEG化学诱导法）和物理方法（电击和激光）。2、 植物细胞工程培养基的选择：MS培养基应用于快繁和脱毒培养，无机盐浓度高，具有高含量的氮，钾尤其硝酸盐用量很大，还有一定数量的铵盐，使其营养丰富，不需要添加更多的有机附加物就能满足植物组织对矿质营养的要求，可加速愈伤组织和培养物生长，即使培养物久不转移，仍可

22、维持其生存。生长素诱导愈伤组织产生，促进细胞分化和细胞伸长生长，促进生根。细胞分裂素：促进细胞分裂和扩大，使茎加粗，抑制茎伸长和根生长，诱导芽分化，抑制衰老，减少叶绿素的分解，有保鲜效果。生长素|细胞分裂素=高，利于生根，比例低，利于生芽，若二者浓度相当，既不利于生根也不利于生芽，愈伤组织产生占优势。3、 植物组织培养应用的理论：植物细胞的全能性。4、 人工种子的结构：体细胞胚（或其类似物）、人工胚乳和人工种皮。体细胞胚是由组织培养产生的具有胚芽、胚根等类似天然种子胚的结构，并具有萌发长成植株的能力。人工胚乳是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质。人工种皮是包裹在人工种子最外层的胶质化合

23、物薄膜，使内外气体交换畅通，防止人工胚乳中水分及各类营养物质渗漏，具备一定的机械抗压力。5、 人工种子制作过程(ppt)：外植体的选择和消毒、愈伤组织的诱导、体细胞胚的诱导、体细胞胚的同步化、体细胞胚的分选、体细胞胚的包裹、包裹外膜、发芽成苗试验。(书上小标题)胚状体的制备及其同步生长、人工胚乳的制备、配制包埋剂及包埋。6、 细胞分化、脱分化和再分化的区别：细胞分化：细胞分化就是由一种相同的细胞类型经过细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程。脱分化：指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。再分化：已经脱分化的愈伤组织在一定条件下，再分化出

24、胚状体，形成完整植株的过程。a脱分化时需要避光培养，再分化时需要光照。b脱分化是从分化细胞到未分化细胞的过程，再分化是从未分化细胞到分化细胞的过程。c当培养基中生长素含量高于细胞分裂素时主要诱导植物组织脱分化和根原基形成（即有利于根发生）；当细胞分裂素含量高于生长素时则主要诱导植物组织再分化和芽原基形成（即有利于芽发生）。d脱分化恢复细胞分裂能力，再分化是基因选择性表达。7、 单克隆抗体的制备过程：实验前数周分次用特异抗原免疫实验动物（如小鼠），使其脾内产生大量处于活跃增值状态的特异B细胞。杀鼠取脾制得含有大量B细胞的脾细胞后，将鼠骨髓瘤细胞和脾细胞以PEG法进行细胞融合。B细胞不能在体外增值

25、而骨髓瘤细胞是HGPRT基因缺陷细胞，所以只有从淋巴细胞获得HGPRT基因等因子的骨髓瘤细胞才能在选择培养基液中生长。对筛选得到的杂合细胞高度稀释后进行单细胞培养，待其增殖成一个细胞群体后，用特异技术分别检测它们产生的抗体，从中挑出能产生所需单一性抗体的杂交瘤细胞。再将其注射到小鼠腹腔，体内培养，然后从腹水中分离，提取单克隆抗体或者将其移到培养瓶或生物反应器中体外培养，再从培养液中回收产生的抗体。 第4章 发酵工程1、 发酵工程上游技术：指采用一种或多种技术手段选育优良菌种，确定优良菌种的营养条件和发酵条件（PH、温度、气体）的技术。包括优良菌种的选育，最适发酵条件（PH、温度、溶氧和营养组成

26、）的确定，营养物的准备3个方面。2、 发酵工程中游技术：指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术，主要包括下列内容：发酵开始前对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术;还有种子培养和生产培养的不同工艺技术。3、 发酵工程下游技术：从发酵液或者培养液中分离、精制发酵代谢产物或次生代谢产物或者菌体的技术。过程一般分为发酵液（培养液）的预处理和固液分离、初步分化、精致和成品加工4个阶段。4、 蛋白质纯化技术：分离纯化步骤1、微生物细胞的收获2、微生物细胞

27、的破碎3、固体杂质的去除4、产物的初步分离浓缩5、产物的进一步纯化 6、产物的最终分离、纯化5、 亲和层析法：根据某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合在固相载体上，同时这种结合在一定条件下是可逆的从而达到与液相中的其他蛋白质分开的目的。6、 发酵产品：抗生素、青霉素、谷氨酸(味精)、维生素C名词解释：1. 基因工程：指将一种或多种生物体（共体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密地设计，经过体外加工重组，通过一定的方法，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。2.DNA重组技术：又称遗传工程，在体外重新组合

28、脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。3载体：承载外源DNA片段（基因）带入受体细胞的传递者. 4插入失活：若把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表性特征，此方法叫插入失活。标记基因多为抗生素抗性基因。5.a-互补: 噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为 半乳糖苷酶的片段。6质粒：存在于细胞中、能独立于染色体之外进行自主复制的共价闭合的环状双链DNA分子。一个质粒就是一个DNA分子，其大小可以从1Kb到200Kb。7转化：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入受

29、体细胞的过程 8PCR（聚合酶链式反应）：是利用体外酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法，以热变性的双链DNA分子为模板，利用引物和四种脱氧核苷三磷酸为原料在聚合酶的作用下大量扩增了特定DNA片段9细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术10细胞融合：在自发或人工诱导下,两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的现象。11人工种子：就是将组织培养产生的体细胞胚或不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防

30、止机械损伤的外膜，造成一种类似于种子的结构。12亲和层析：利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱方法,13基因修复：指在原位修复有缺陷的基因，将靶细胞中致病基因的突变碱基序列加以纠正，使其在质和量上均能得到正常表达。 14基因治疗：指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的。15发酵工程：是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。16蛋白质工程：以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千

31、上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。17植物组织培养：指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。18疫苗：是为了预防、控制传染病的发生、流行，用于人体或动物预防接种的生物制品。第 15 页 共 15 页 17的姑娘们，努力吧！始终坚信明天会更好哦！第五章 酶工程与蛋白质工程1酶工程：利用酶的催化特点，在工业上设计一定的反应器和反应条件，有目的的生产人类需要的产品和服务于其他领域的一门技术性学科。2酶的分离纯化的大致步骤：1）、材料的预

32、处理 2）、细胞破碎3)、酶的抽提4)、酶的分离纯化3.酶的分离纯化层析法(1)离子交换层析：利用离子交换剂上可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离目的的一种层析法原理：蛋白质是两性电解质，由于不同蛋白质的等电点不同，导致其在同一PH介质中电离状态不同，分子所带电荷的种类和数量也不同，最终与离子交换树脂的静电吸附能力也有差异。通过在层析中的上样吸附和改变离子强度或PH的解吸附作用，可使蛋白质依其静电吸附能力，按由弱到强的顺序各自分离开来。(2)亲和层析：是利用蛋白质分子与其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。原理：亲和层析

33、是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。此法高效、快速、简便（3）凝胶层析：分离机制是由于凝胶颗粒上的孔隙大小有一定的分布范围，称筛分范围，对分子大小不同的组分起到不同的阻滞作用。被分离物质中，大分子组分由于直径大，不易进入凝胶微孔内，随流动相向前移动较快，首先流出柱床，而小分子组分则能够进入凝胶微孔内，向前移动较慢，这样使各组分在柱中迁移速度不同而达到相互分离的目的。4蛋白质的分子结构：

34、一级结构：指多肽链的氨基酸残基的排列顺序。二级结构：多肽链中主链骨架本身在空间上有规律的折叠盒盘绕，它是氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。三级结构：指整条多肽链的三维结构，包括骨架和侧链在内的所有原子的空间排列。四级结构：指在亚基和亚基之间通过疏水作用等次级键结合成为有排列的特定的空间结构。5.蛋白质结构预测同源建模法同源建模的基本过程：目标序列与模板序列的匹配;根据同源蛋白的多重比对结果，确定同源蛋白的结构保守区及相应的框架结构;目标蛋白结构保守区主链建模;目标蛋白结构变异区的主链建模;侧链的安装和优化;模型评估.一般，序列同源性越差，匹配的准确程度越低。当序列相似度超过50%时，模型质

35、量非常好。当序列相似度介于30%-50%时，模型的准确度开始下降，低于30%，模型错误会急剧上升。蛋白质改造程度类型：（1）小改：个别碱基的修饰改造（2）中改：一小段序列蛋白质的修饰改变(3)大改：全新蛋白质设计1.基因工程操作的三大基本元件是【 A】I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + IV + V2.基因工程作为一种技术诞生于【C 】1972年 上世纪 50 年代初 上世纪 60 年代初 上世纪 70 年代初 上世纪 80 年代初 上世纪 90 年代初3.天然 PstI 限制性内切

36、酶的来源是 【D 】 Bacillus amyloliquefaciens Escherichia coli Haemophilus influenzae Providencia stuartii 4、 下列几个 DNA 片段中含有回文结构的是 【 D】 GAAACTGCTTTGAC GAAACTGGAAACTG GAAACTGGTCAAAG GAAACTGCAGTTTC 5、 下列不属于获取目的基因的方法是BA.“鸟枪法” B.转录法C.反转录法 D.根据已知氨基酸序列合成法6.T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是 【 C】A 2 -

37、OH 和 3 -P B 3 -OH 和 2 -P C 3 -OH 和 5 -P D 5 -OH 和 3 P7.-DNA 体外包装的上下限是天然 -DNA 长度的 【D 】 25 - 50 % 50 - 100 % 75 - 100 % 75 - 105 % 100 - 125 % 8.若某质粒带有 lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入 【 D】 半乳糖 葡萄糖 蔗糖 X-gal9.cDNA 第一链合成所需的引物是 【 A】 Poly A Poly C Poly G Poly T 发夹结构10.cDNA 合成中所涉及的三种工具酶是 【 C】 I T 4 -DNA 连接

38、酶 II Klenow 聚合酶 III S1 核酸酶 IV Bal31 核酸酶 V 逆转录酶 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + III + V III + IV + V11.为了利用 PCR 技术扩增下列染色体 DNA 片段上的虚线部分，应选用的引物顺序是 【 D】 I + II I + III I + IV II + III II + IV 12.在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA片段？DNA的表达需要起始子和终止子，而单独的外援DNA片段是没有的，就不能成功表达，所以要用限制酶分别切载体和所需的DNA，让他们产

39、生相同的末端，把外源DNA加进去，才能成功克隆13.请描述用载体PUC18来克隆DNA片段的过程，在这个克隆实验中你怎样选择含有外源DNA 片段的重组子？pUC18中的reporter gene是LacZ，而它的MCS(multiple cloning sites)是在LacZ基因中的。当没有外源DNA片段的pUC18载体直接转化进入E.coli细菌时（不含有Amp抗体基因和LacZ基因的细胞系），在适当加入IPTG和x-gal的LB/amp培养基上，菌落生长呈蓝色。而没有转入pUC18的菌落由于无法存活在Amp培养基上而死亡。当你的外源DNA片段克隆进入pUC18载体后，LacZ基因被破坏，

40、当此载体转入细菌细胞后，其依然可以生长在LB/Amp培养基上（载体上的Amp抗性基因依然可以被转录发挥作用），但是在加入IPTG诱导的x-gal培养基上，由于其LacZ基因被破坏，所以菌落颜色成白色。因此，将外源基因克隆进pUC18后，并将其转化入不含有Amp抗体基因和LacZ基因的E.coli菌株中，将其生长在LB/Amp(IPTG+, x-gal+)的培养基上，选择白色的菌落即含有你的目标克隆片。14.基因工程的单元操作顺序是【 B】A ：增，转，检，切，接 B ：切，接，转，增，检 C ：接，转，增，检，切 D ：切，接，增，转，检15.在基因工程中，切割载体和含有目的基因的DNA片段中

41、，一般需使用AA. 同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶16.下列哪项叙述不是运载体必须具备的条件 BA.具有某些标记基因B.决定宿主细胞的生存C.能够在宿主细胞中复制D.有一个或多个限制酶切点17.水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中有三种氨基酸构成发光环，现已将这种蛋白质 的基因作为生物转基因的标记。在转基因技术中，这种蛋白质的作用CA.促使目的基因导入宿主细胞中 B.促使目的基因在宿主细胞中复制C.使目的基因容易被检测和选择D.使目的基因容易成功表达18.基因工程第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来，这要利用限制性内切酶。一种限制性内切酶能识别DNA子中的

42、GAATTC顺序，切点在G和A之间，这是 应用了酶的BA高效性B.专一性C多样性D.催化活性受外界条件影响19.下列属于PCR技术的条件的是 单链的脱氧核苷酸序列引物目的基因所在的DNA片段脱氧核苷酸核糖核苷酸DNA连接酶DNA聚合酶DNA限制性内切酶A. B. C. D.20.限制性内切酶可以专一地识别(B) A双链DNA的特定碱基对B双链DNA的特定碱基序列C特定的三联体密码子D以上都不对21.用“鸟枪法”提取目的基因的步骤为B用限制性内切酶将供体细胞DNA切成许多片段将许多DNA片段分别载入运载体选取目的基因片段插入运载体通过运载体转入不同的受体细胞让供体DNA片段在受体细胞内大量繁殖找

43、出带有目的基因的细胞，并分离出目的基因A： B： C： D：22.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是( C )A人工合成基因 B目的基因与运载体结合C将目的基因导入受体细胞 D目的基因的检测与表达23.限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶BamHI，EcoRI，Hind以及Bgl的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？ABamHI和EcoRI；末端互补序列AATTBBamHI和Hind；末端互补序

44、列GATCCEcoRI和Hind；末端互补序列AATTDBamHI和BglII；末端互补序列GATC24.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：A过程需要的酶有_限制性内切酶 连接酶_。要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用氯化钙 处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为细胞工程题1、在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列各项中为非必要条件的是（C） A培养基需消毒灭菌 B给予适宜的温度 C给予充足的光照D给予适宜的养料和激素2、运用此植物体细胞杂交法可

45、使本来存在着生殖隔离的物种进行杂交，培育出兼有两种品质的优良品种。要大量繁殖这样的优良品种，最好用下列哪种方法（C）A单倍体育种法B杂交育种法C植物组织培养法D花药离体培养法3、在植物组织培养中，培养基的pH值一般为（ B ）A 低于5.0 B 5.55.8 C 6.07.0 D 7.0以上4、对于花药培养和花粉培养，下列说法正确的是（ A ）A 花药培养属器官培养，花粉培养属细胞培养B 花药培养属细胞培养，花粉培养属器官培养C 两者都属于器官培养 D 两者都属于细胞培养 5、植物组织培养形成的愈伤组织进行培养， 又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为（ C ） A、脱分化 B、去分化 C、

46、再分化 D、脱分化或去分化6、下列不能作为植物组织培养的材料是：（ D ）A、秋海棠的叶 B、马铃薯的块茎C、成熟的花粉 D、木质部中的导管细胞7、生长素与细胞分裂素在植物组织培养中的作用是（ B ）A 生长素促进芽的生长，细胞分裂素促进根的生长B 生长素促进根的生长，细胞分裂素促进芽的生长C生长素与细胞分裂素均促进根的生长D生长素与细胞分裂素均促进芽的生长8、培养室里的湿度一般保持在(C ) 培养瓶湿度为100%A 3040%；B 5060%；C 7080%；D 8090%9、下列实验中可能获得单倍体植株的是( D )。A 小麦的茎尖培养；B番茄花药培养；C玉米胚乳培养；D玉米花粉培养10、

47、诱导试管苗生根时，培养基的调整应( D )A、加大盐的浓度 B、加活性炭 C、加大分裂素的浓度 D、加大生长素的浓度11、诱导试管苗分化丛芽，培养基的调整应(B )。A加大生长素的浓度 B加大分裂素的浓度 C加活性炭 D 降低盐的浓度12、植物组织培养可用于：( ABCD )。A 快速繁殖；B 脱除病毒；C减少品种变异D 育种13、经诱导融合得到的杂种细胞还需经过下列哪项措施才能得到杂种植株（ B）A、分离杂种细胞，直接接种便可获得B、筛选鉴定杂种细胞后，再经植物组织培养才能获得植株C、让杂种细胞自交获纯系植株D、杂种细胞经传代培养成植株14、“生物导弹”是指（ D）A、单克隆抗体B、杂交瘤细

48、胞C、产生特定抗体的B淋巴细胞 D、在单克隆抗体上连接抗癌药物15、下列过程中，没有发生膜融合的是（ C ）A、植物体细胞杂交B、受精过程C、氧进入细胞中的线粒体 D、单克隆抗体的产生16、动物细胞工程技术的基础是（ D ）A、动物细胞融合B、单克隆抗体C、胚胎移植D、动物细胞培养17、芦荟经初代培养得到株无菌苗，以后按每0天继代增殖一次，每次增殖倍数为倍，一年后繁殖苗有( B )A 3410株 B 4 312株 C 310株 D 412株18、植物组织培养是指（ C ） A、离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织 B、愈伤组织培育成植株 C、离体的植物器官、组织或培养成完整的植物体 D、愈伤组织形成高度液泡化组织 19、关于杂交瘤细胞的叙述中，正确的是（D）百度上是不正确的是BA、有双亲细胞的遗传物质 B、无增殖的本领C、可分泌出特异性抗体 D、有大量增殖的本领20、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体。与骨髓瘤细胞融合的是（ A ）A、经过免疫的B细胞 B、没经过免疫的T细胞C、经过免疫的T淋巴细胞 D、没经过免疫的B淋巴细胞21、新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。下列技术（或仪器）与应用匹配正确的是（BD）APCR 技术扩增蛋白质B杂交瘤技术制备单克隆抗体C光学显微镜观察叶绿体的基粒