外周血miR—29a—3p、miR—365a—3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的表达

1、外周血 miR29a3p、miR365a3p 在活动性肺结 核和结核潜伏感染者中的表达微小RNA（ microRNA, miRNA是一类广泛存在于真核细胞 中，长度约20 nt的高度保守的非编码 RNA调控因子，是由全长 的mRNA羊转录子加工而来，通过与对应的靶mRNA勺3非翻译区的非完全或完全配对结合， 阻止其翻译或破坏其稳定性， 实现 对基因表达的调控，越来越多的研究表明，miRNA在肿瘤、糖尿病、心血管疾病、病毒感染等多种疾病中都起着重要作用，是正 常和疾病状态下基因调节的一个新的机制1-2。近年miRNA在肺结核患者中表达也是研究热点之一。本研究主要探讨miR-29a-3p、miR-

2、365a-3p分子在活动性肺结核（TB）和结核潜 伏感染（LTBI）者外周血中的表达情况。1 资料与方法1.1 一般资料收集深圳市南山区慢性病防治院 （以下简称“我院”） 结核 病防治科门诊2012年110月诊治的TB患者30例，其中男17 例，女 13例，平均年龄（ 26.110.1）岁，诊断标准：经痰抗 酸杆菌涂片阳性，临床症状结合 X线表现、CT诊断以及病原学 检查，符合全国结核病分类与诊断标准； LTBI 者 30 例，其中男 14例，女 16例，平均年龄（ 28.99.5）岁，判定标准：采用 结核菌特异性酶联免疫斑点试验阳性，而胸片未见异常 3 。两 组研究对象之间的年龄、 性别比较

3、差异无统计学意义 (P 0.05 )。 所有研究对象均排除 HBV、HCV、HIV 病毒感染及其他慢性疾病如 高血压、糖尿病、肾炎、自身免疫性疾病等。所有研究对象均经 我院伦理委员会批准通过，并签署知情同意书。1.2 标本的收集和处理抽取外周静脉血 2 mL, 30 min内分装200卩L全血于冻存 管中(已预装有Trizol和研磨珠)，振荡混匀后-80C保存；根 据 Trizol Reagent 试剂盒说明书( Invitrogen )抽提总 RNA， 核酸测定仪测定浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA勺完整性；-80C保存。1.3 研究方法1.3.1 全血RNA提取 加入1 mL Triz

4、ol ，充分裂解细胞， 加入200卩L氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min,12 000 r/min , 4C,离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加入1.5倍体积异丙醇充分混匀，室温放置10 min。12 000 r/min , 4C,离心10 min , RNA沉淀于管底，倾倒上清，沉淀物用75%乙醇洗涤2次，室温晾干10 min，加入适量无RNase水充分溶解，调 整RNA浓度。1.3.2反转录-荧光定量PCR佥测miRNA反转录反应体系为 20卩L, 0.5 g/L 总RNA 1卩L, 2X反转录缓冲混合物 10卩L, RNase Free水5卩L,反转录酶 2 L,

5、 0.1% BSA 2卩L。反转 录反应条件为 37C 60 min , 85C 5 min , 4C 5 min。荧光定量PCF反应体系为25卩L, cDNA模板2卩L,水8.5卩L, SYBRGreen 12.5卩L, 上游引物1卩L,下游引物1卩L。荧光定量 PCF反应条件为预变性 95C 1 0 s ;变性和延伸95C 5 s ; 60C20 s ,共 40 个循环。引物采用在线设计软件： http ：/tools/primer-blast/；管家基因 U6为内参照,测得的数据用平均相对含量表示。引物由 invitrogen 合 成,引物序列见表 1。1

6、.4 统计学方法采用 SPSS13.0 统计软件进行数据分析,比较两组间差异采 用 t 检验,相关性分析采用 Pearson 检验,以 P 0.05 ）。见图 2。2.3 结核潜伏感染者外周血 miR-29a-3p 表达与结核菌特异 性酶联免疫斑点数相关性分析相关性分析发现, LTBI 外周血 miR-29a-3p 表达与结核菌特异性酶联免疫斑点数呈负相关（r = -0.42,P = 0.02 ）。见图 3。3 讨论miRNA在细胞生长发育、分化、增殖、凋亡、肿瘤发生等发 生发展中均起到重要作用。越来越多的研究发现miRNAs表达失调与多种疾病发生（如病毒感染、心血管疾病、肺部疾病、纤维 化、

7、肿瘤等）密切相关。近年来研究也发现miRNA可以参与调节免疫细胞的成熟、增殖、分化和活化，miRNA通过选择性表达，干扰、降解或抑制靶基因的 mRN,A 从而调控免疫反应,其在固有免疫应答和适应性免疫应答中均起到重要作用， 如通过下调信 号通路TCR中多种蛋白磷酸激酶活性，调节TCR言号通路强度4;通过下调促凋亡蛋白和肿瘤抑制因子，促进T细胞、B细胞增殖；通过下调SOCS信号通路调节Treg细胞发育、通过 下调AID调节B细胞抗体类别转换6-7，以及通过下调多种转 录因子调节髓样细胞的增殖和分化等多种形式。microRNA-29a( miR-29a)是新近发现的一个与多种疾病发 生紧密相关的小

8、分子 RNA家族，除3端非编码区碱基区域(3 untranslated region，3UTR)外，miR-29 也可与非 3UTR 区内的 miRNA调节元件(miRNAregulator elments， MRE 结合发 挥作用。弹性蛋白3UTR和编码区共有14个miR-29的结合位点， 荧光素酶报告基因分析方法证实：miR-29可通过同时与编码区内和3UTR的MRE吉合来抑制弹性蛋白表达， 编码区内的MRE在 miR-29 抑制弹性蛋白的表达中起到了协同作用。研究发现 miR-29 靶基因主要的是细胞外基质及迁移蛋白 8-9 ， miR-29 可 直接抑制多种胶原蛋白表达。而胶原蛋白异常

9、聚集可导致纤维 化，因此 miR-29 在抗纤维化中起到重要作用。目前研究也发现 miR-29a在机体免疫反应中也起到重要作用，miR-29a靶基因相关蛋白参与多个信号通路。miR-29a可通过抑制这些信号蛋白表达参与多条信号通路的调控。 其中miR-29a是经典Wnt通路中信 号分子一一T细胞因子(T-cellfactor ，TCF或淋巴样增强因 子(lymphoidenhancerfactor ， LEF)的负调控分子，miR-29a可通过靶向降解IFN- 丫降低机体对胞内病原体的免疫应答10-11 。本研究也发现 LTBI 外周血 miR-29a-3p 表达明显高于 活动性肺结核患者组，

10、 LTBI 外周血 miR-29a-3p 表达与结核菌特 异性酶联免疫斑点数呈负相关， miR-29a-3p 表达高的，结核菌 特异性酶联免疫斑点数却较少， 而结核菌特异性酶联免疫斑点数 反应了 T细胞分泌IFN- 丫的能力，因此miR-29a-3p在肺结核感 染、发病过程中可能起到重要作用。IL-6 是介导组织炎症的重要细胞因子，趋化、活化中性粒 细胞和单核细胞，促进炎症递质释放，增强局部炎性反应。研究 发现 miR-365a 可负性调节 IL-6 表达，抑制 IL-6 蛋白生成， miR-365通过与IL-6 基因的3UTR的MRE吉合，直接抑制IL-6 mRNA表达，除此之外，miR-365也可能通过非直接途径抑制 IL-6 表达，体外实验发现 miR-365 调节 IL-6 的能力超过 let-7a12，因此 miR-365a 在炎性反应中也起到重要作用，但本研究中并未