第四章++基因在大肠杆菌和酵母的高效表达

1、第四章第四章 基因在大肠杆菌、基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达酵母中的高效表达 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲袁婺洲本章目录本章目录4.1 4.1 基因的表达系统与表达策略基因的表达系统与表达策略4.1.1 4.1.1 基因的表达系统基因的表达系统4.1.2 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略根据表达蛋白用途选择基因的表达策略4.2 4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达基因在大肠杆菌中的高效表达4.2.1 4.2.1 基于基于T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶/ /启动子的大肠杆菌表达系统启动子的大肠杆菌表达系统4.2.2 4.2.2 蛋白质的融合

2、表达蛋白质的融合表达4.2.3 4.2.3 蛋白质的分泌型表达蛋白质的分泌型表达4.2.4 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性4.3 4.3 基因在酵母中的高效表达基因在酵母中的高效表达4.3.1 4.3.1 酵母表达系统概述酵母表达系统概述4.3.2 4.3.2 甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统4.3.3 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达 第一节第一节 基因的表达系统与表达策略基因的表达系统与表达策略 l基因的表达系统基因的表达系统l基因的高效表达策略基因的高效表达策略一、基因的表达系统一、基因

3、的表达系统l表达载体的组成：lDNADNA复制及质粒复制及质粒DNADNA的筛选的筛选: : 有有DNADNA复制起点复制起点ori, ori, 及及Amp, TetAmp, Tet抗抗性基因性基因l目的基因转录的调控系统目的基因转录的调控系统: :这一系统包括启动子这一系统包括启动子, ,抑制物基因和转抑制物基因和转录终止子录终止子. .启动子位于目的基因的上游启动子位于目的基因的上游, ,常用的如常用的如PlaczPlacz等等. .l蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统: :包括核糖体识别位点包括核糖体识别位点SD,SD,翻译起始密码子和终翻译起始密码子和终止密码子止密码子. .表达系统的种

4、类表达系统的种类l原核表达系统原核表达系统l真核表达系统真核表达系统 酵母酵母 植物拟南芥植物拟南芥 昆虫昆虫 哺乳动物细胞系哺乳动物细胞系一）一） 原核表达系统：细菌原核表达系统：细菌大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定基因克隆及表达系统成熟完善基因克隆及表达系统成熟完善 全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋

5、白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素二）真核表达系统二）真核表达系统l全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便l大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉l具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统l能将外源基因表达产物

6、分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中l不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的认定为安全的酵母表达系统酵母表达系统l可以悬浮培养可以悬浮培养, , 生生长快长快, , 连续传代连续传代l精确的糖基化精确的糖基化l胞外表达胞外表达l人本身的细胞系，人本身的细胞系，人的表达系统人的表达系统二、基因的高效表达策略二、基因的高效表达策略l用于生物化学和分子生物学研究：用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持重点考虑如何保持蛋白质原有的功能蛋白质原有的功能l表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白

7、及表达融合蛋白的策略略, ,考虑如何便于分离考虑如何便于分离l 用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质，保持结构用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质，保持结构完整完整第二节第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达基因在大肠杆菌中的高效表达 大肠杆菌高效表达设计大肠杆菌高效表达设计 基于基于T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶/ /启动子的大肠杆菌表达系统启动子的大肠杆菌表达系统 蛋白质的融合表达蛋白质的融合表达 蛋白质的分泌型表达蛋白质的分泌型表达 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性一、一、外源基因在大肠杆菌中高效表达的设计外源基因在大肠杆菌中高效表达的设计启

8、动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数1.启动子启动子的构建-35 区序列区序列-10 区序列区序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac启动子启动子T T G A C AG A T A C TT T G A T AT A T A A TT T G A C AT T A A C TT A G A C AT A A T G TT T T A C AT A T A A TT T G A C AT A T A A TPtac = 3 Ptrp = 11 Plac启动子启动子的可控性P乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性：的可控性：OPO高效转录

9、高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖 异丙基异丙基-b b-D-硫代半乳硫代半乳糖苷（糖苷（IPTG）基底水平转录基底水平转录启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性Plac乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性：的可控性：OPlacO高效转录高效转录葡萄糖代谢葡萄糖代谢基底水平转录基底水平转录基因工程中使用的乳糖启动基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即突变型，即Plac UV5CAPcAMPcAMP浓度降低浓度降低Plac UV5O高效转录高效转录2. 2. 核糖体结合位点核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构：大肠杆菌核糖体

10、结合位点包括下列四个特征结构：位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的6-86-8个核苷酸序列个核苷酸序列：5 5 UAAGGAGG 3UAAGGAGG 3，即即Shine-DalgarnoShine-Dalgarno（SDSD）序列序列，它与，它与大肠杆菌核糖体小亚基中的大肠杆菌核糖体小亚基中的1616S rRNA 3S rRNA 3端区域端区域3 3 AUUCCUCC 5AUUCCUCC 5并与之专一性结合；并与之专一性结合；翻译起始密码子翻译起始密码子AUGAUG； SD SD序列与翻译起始密码子之间的距离序列与翻译起始密码子之间的距离(7bp)(7bp)及碱基及碱基组成；组成；

11、基因编码区基因编码区5 5 端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列 二、二、 基于基于T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶/ /启动子的大肠杆菌启动子的大肠杆菌表达系统表达系统优点：1 1）T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶合成聚合酶合成RNARNA的速度高于大肠杆菌的速度高于大肠杆菌5 5倍；倍；2 2）T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠杆菌杆菌DNADNA任何序列的转录；任何序列的转录；3 3）T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶对抑制大肠杆菌聚合酶对抑制大肠杆菌RNARNA聚合酶的抗生素有聚

12、合酶的抗生素有抗性；抗性；4 4）T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶/ /启动子系统在一定条件下，基因表达启动子系统在一定条件下，基因表达产物可占细胞总蛋白的产物可占细胞总蛋白的2525以上。以上。 载体与受体系统载体与受体系统l载体：载体：pETpET表达系统表达系统（pET15pET15，pET16pET16，pET28pET28，pET30pET30，pET42pET42等等a/b/ca/b/c三套，及三套，及pRSETpRSET） l大肠杆菌菌株：大肠杆菌菌株：BL21(DE3)BL21(DE3)和和BL21(DE3)pLysSBL21(DE3)pLysS。(DE3)(DE3

13、)菌株基菌株基因组上以溶原形式携带一个克隆的因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNAT7RNA聚合酶基因，聚合酶基因，IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代D D半乳糖苷）可诱导半乳糖苷）可诱导T7RNAT7RNA聚合酶大量合聚合酶大量合成成。 T7T7启动子启动子pET28a 结构结构MCSlacZ三、三、 蛋白质的融合表达蛋白质的融合表达 l蛋白质融合表达是指蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行并作为一个新的开放阅读框进行表达。表达。l在这种融合蛋白结构中，通常载体的在这种融合蛋

14、白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于担体蛋白部分位于N N端，目的蛋白位于端，目的蛋白位于C C端。端。l通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收目的蛋白。收目的蛋白。谷胱甘肽谷胱甘肽S S转移转移酶（酶（GSTGST）融合蛋）融合蛋白表达系统白表达系统pGEX载体载体酶促裂解法：多残基位点酶促裂解法：多残基位点启动子启动子 担体基因担体基因 接头接头 目的基因目的基因MetArgStop Ile-Glu-gly-Arg凝血因子凝血因子XaX

15、a的识别、作用序列的识别、作用序列Ile-Glu-gly-Arg表达表达亲和层析亲和层析酶解回收酶解回收用于融合蛋白构建的担体蛋白：用于融合蛋白构建的担体蛋白：融合型目的蛋白表达系统的构建谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶（GSTGST） 维持良好空间构象维持良好空间构象金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A A（SAPASAPA） 免疫亲和层析免疫亲和层析 pRIT2TpRIT2T硫氧化还原蛋白（硫氧化还原蛋白（TrxATrxA） 维持良好空间构象维持良好空间构象 pTrxFuspTrxFusb-b-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZLacZ） 免疫亲和层析免疫亲和层析泛素蛋白（泛素蛋白（UbiU

16、bi） 维持良好空间构象维持良好空间构象以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白表达率高目的蛋白表达率高目的蛋白溶解性好目的蛋白溶解性好目的蛋白需要回收目的蛋白需要回收目的蛋白的回收目的蛋白的回收化学断裂法化学断裂法：如：如溴化氰（溴化氰（CNBrCNBr）它与多它与多肽链中的肽链中的甲硫氨酸甲硫氨酸残基侧链的残基侧链的硫醚基硫醚基反反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段。降解片段。酶促裂解法酶

17、促裂解法 酶促裂解法酶促裂解法：单残基位点：单残基位点蛋白内切酶蛋白内切酶切割位点切割位点梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg-C葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶 Glu-C假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶 Lys-C猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶 Arg-C Lys-CArg CNNC担体蛋白担体蛋白目的蛋白目的蛋白每种蛋白酶均具有相应的每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决断裂位点决定簇定簇单残基位点断裂的蛋白酶单残基位点断裂的蛋白酶如在如在精氨酸精氨酸、谷氨酸、赖氨酸谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，使目的蛋白分离残基处切开酰胺键，使目的蛋白分离酶促裂解法：多残基位点酶促裂解法：多残基位点启动子启动子 担体基因担体基因

18、接头接头 目的基因目的基因MetArgStop Ile-Glu-gly-Arg凝血因子凝血因子XaXa的识别、作用序列的识别、作用序列Ile-Glu-gly-Arg表达表达亲和层析亲和层析酶解回收酶解回收四、四、 蛋白质的分泌型表达蛋白质的分泌型表达 l是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带有有N N端信端信号肽的前体形式号肽的前体形式首先在细胞质中合成，随后穿膜运首先在细胞质中合成，随后穿膜运送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过程中，信号肽被信号肽酶切除。将目的蛋白的基因程中，信号肽被信号肽酶切除。将目

19、的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型表达。表达。 分泌表达的优点：分泌表达的优点： 信号肽被切除后的蛋白质N末端的氨基酸序列与天然蛋白是一致的周质空间中的蛋白酶活性比细胞质中的要低，从而使蛋白质较稳定地存在于周质中周质中只有少量的细菌蛋白，使分离纯化更容易周质空间存在一个氧化的环境，使得二硫键更容易形成 五五 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性性 l在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusi

20、on Bodies，IB）。l蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。l由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。 能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂

21、解后，直接通过高速离细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。得到具有正确空间构象的目标蛋白。以包涵体形式

22、表达目的蛋白的操以包涵体形式表达目的蛋白的操作作如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。的载体。包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作（1 1）包涵体的溶解与变性）包涵体的溶解与变性拆开错配的拆开错配的二硫键和次级键二硫键和次级键能有效促进包

23、涵体溶解变性的试剂和条件包括：能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂清洗剂：SDSSDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化促溶剂促溶剂：盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂混合溶剂：如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端极端pHpH：廉价，但许多蛋白质在极端廉价，但许多蛋白质在极端pHpH条件下发生修饰反应条件下发生修饰反应包涵体的变性与复性

24、操作包涵体的变性与复性操作（2）包涵体的复性与重折叠（）包涵体的复性与重折叠（refolding）：）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的将多肽链中被拆开的游离巯基游离巯基重新折叠重新折叠通过通过次级键次级键的形成使蛋白质复性的形成使蛋白质复性包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性包涵体的复性分段稀释法，分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生试剂添加法，试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEGPEG、Ca2+Ca2+蛋白修饰法，蛋白修饰法

25、，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚分子伴侣法，分子伴侣法，GroELGroEL、GroESGroES、DnaKDnaK，固定化，共表达固定化，共表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的重折叠（包涵体的重折叠（refolding）：）：二硫键形成二硫键形成HSHS S S+2e+2H+AHSHS S-S-R HS+BR-S-S-R S S2R-SH化学氧化法（化学氧化法（A A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成随需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠机的，

26、仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠二硫键交换（二硫键交换（B B）需要还原型和氧化型需要还原型和氧化型谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSHGSH和和GSSGGSSG），），二硫键形成二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好六、六、 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB 肽（肽（30）C 肽（肽（31）A 肽（肽

27、（21）RRRKSSSSCNSSNC高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶NC信号肽信号肽B 肽肽C 肽肽A 肽肽信号肽酶信号肽酶基因工程法制人胰岛素基因工程法制人胰岛素 1982 1982年，美国年，美国Ely LiLiEly LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 由基因工程菌合成的重组人胰岛素在由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血

28、浆药动力学药动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。物医药领域中的巨大潜力。重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和链和B链分别表达法链分别表达法tactacb b-Galb b-GalA peptideB peptideorioriAprAprMetMetMetMetMMNCMMNC化学合成化学合成A链链和和B链的编码链的编码序列序列重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组

29、人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和链和B链分别表达法链分别表达法MMNCMMNCb b-Galb b-GalABCNBr 处理处理NCSSSSCNSSNCNCNCNCCys 体外氧化和重折叠体外氧化和重折叠分离纯化分离纯化重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 由于由于A A链和链和B B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%10% - 20%，因此采用这，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达10010

30、0美元以上美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLiEly LiLi公司随后又公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。A A链和链和B B链分别表达法链分别表达法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法tacb b-GalC peptideoriAprMetMetMMNCB peptideA peptide人胰岛素原的人胰岛素原的cDNA重组人胰岛素原重组人胰岛素原转化转化分离纯化分离纯化重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌

31、工程菌的构建人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法SSSSCN胰蛋白酶胰蛋白酶C peptideA peptideB peptideMRRKRCNBrRSSSSCNNCS SS SR羧肽酶羧肽酶BB链中第链中第22位上的位上的Arg和第和第29位上的位上的Lys由于良好折叠的原由于良好折叠的原因，对胰蛋白酶不敏感因，对胰蛋白酶不敏感重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法 在人胰岛素原表达工艺中，由于在人胰岛素原表达工艺中，由于C C肽的存在，胰岛肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对素原能形成良好的空间构象，三对二硫

32、键的正确配对率也相应提高，折叠率高达率也相应提高，折叠率高达80%80%以上。虽然这条工艺路以上。虽然这条工艺路线并不比线并不比ABAB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅5050美元。美元。 目前美国目前美国Ely LiLiEly LiLi公司采用此工艺年产十几吨的公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。重组人胰岛素。第三节第三节 基因在酵母中的高效表达基因在酵母中的高效表达l酵

33、母表达系统概述酵母表达系统概述l甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统l组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达 一一 酵母表达系统概述酵母表达系统概述优点：克服大肠杆菌表达系统的不足，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等。 酵母宿主菌酵母宿主菌酿酒酵母系统：酿酒酵母系统：酵母属酵母属 如如酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）甲醇酵母表达系统如：甲醇酵母表达系统如：毕赤酵母属毕赤酵母属 如如巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属裂殖

34、酵母属 如如非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酵母菌电击转化法酵母菌电击转化法用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白 aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418 cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型二、二、 甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统l利用甲醇作为唯一碳源。乙醇氧化酶将甲醇氧