基因的克隆与分离(2)课件

1、LOGO第三章 基因的克隆与分离Company name 目目 录录结构基因的组成结构基因的组成转录启动区核糖体识别区编码区转录终止区起始密码ATG开放读码框终止码TAG、TAA、TGACompany name目的基因的定义目的基因的定义准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。Company name第四章第四章 目的基因获取目的基因获取2. 构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法3. PCR分离法分离法4. 化学合成法化学合成法Company name第一节第一节 直接分离法直接分离法231限限制制性性内内切切酶酶法法随随机机片片断断化化物物理理化化学学法法

2、Company name用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片断。大小的片断。酶切酶切1. 1. 限制性内切酶法限制性内切酶法Company name适合于从简单的基因组中分离目的基因从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.应用对象应用对象1、对已知序列的、对已知序列的DNA分子分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。2、对已知定位的目的基因、对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获

3、得。3、即使含目的基因的、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。Company name由于带有粘性末端，产物可以直接与载由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。体连接。目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点。也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene 优点优点缺点缺点Company name控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。的酶切位点只有一部分

4、被随机切开。影响所切出的产物的长度和随机程度。影响所切出的产物的长度和随机程度。2、随机片断化、随机片断化2.1 限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法限制性内切酶的选用原则限制性内切酶的选用原则 内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数 内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。能与常用克隆位点相连。Company name（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNA，可使其断，可使其断裂成约裂成约300bp的随机片断。的随机片断。（2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随机片断。的随机片断。2.2 机械切割

5、法机械切割法Company name 基本原理：DNA分子的两条链存在着GC、AT碱基配对，其中其中GC间存在间存在3个氢键、个氢键、AT间存在间存在2个氢键，个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解浮力密度和解链温度等也明显不同，链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。密度梯度离心法非洲爪瞻5SDNA单链酶解法根据其热稳定海胆DNA3 物理化学法物理化学法Company name第四章第四章 目的基因获取目的基因获取2. 构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法3. PCR分离法分离法4. 化学合成法化学合成法Company

6、name 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将切割成大小合适的片断，并将所有这些所有这些片断片断都与适当的载体连接，引入相应的都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中宿主细胞中保存和扩增保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的该生物体的全部基因全部基因，称为基因文库。，称为基因文库。第二节第二节 构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法1. 基因文库（基因文库（gene library）Company name一、基因文库一、基因文库某一生物部分基因的集合叫某一生物部分基因的集合叫该生物的亚基因组文库。

7、该生物的亚基因组文库。某一生物全部基因的集合某一生物全部基因的集合叫该生物的基因文库。叫该生物的基因文库。Company namev 载体的制备；载体的制备；v 高纯度大分子量基因组高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取；的提取；v HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离的部分酶切与脉冲电泳分级分离；v 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；v 重组克隆的挑取和保存。重组克隆的挑取和保存。 基因组基因组 DNA 文库的构建程序包含文库的构建程序包含 5 个部分：个部分：Co

8、mpany name断点完全随机，片断长度合适于载体连接。断点完全随机，片断长度合适于载体连接。超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）。）。 物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。可得到进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。 酶切法：酶切法：2. 基因文库构建的一般步骤基因文库构建的一般步骤（1）染色体）染色体DNA片段的制备片段的制备Company name（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目

9、。的重组子的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。片断数目越少，所需的重组子越少。（1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列： 容量为容量为 约约20 kp cosmid载体：载体： 容量为容量为 45 kb YAC： 容量为容量为 230kb-1700kbBAC: 容量为容量为 300 kb（2）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用Company name 粘性末端直接连接粘性末端直接连接载体与外源载体与外源DNA大片段的两个末端大片段的两个末端都有相同的粘性末端。

10、都有相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法（人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。载体与基因组载体与基因组DNA大片段的连接方式大片段的连接方式Company name各种酶的接头可以向公司定做或购买各种酶的接头可以向公司定做或购买接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR co

11、scos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库文库的代表性和随机性文库的代表性和随机性文库的代表性文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可片段可以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任何一段基因组何一段基因组DNA。C

12、ompany name一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所时所需要的克隆数目。需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f: 插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因片断的平均长度占整个基因 组组DNA的百分数的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）3. 基因组文库的大小基因组文库的大小例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断的平均长度如果是片断的平均长度如果是1.7104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=

13、ln (1-99%)ln (1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；大小；f：fragment大小大小N=4.61Gf=4.6131091.7104= 8.1105 文库的质量检测文库的质量检测克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量就越好。越高，文库质量就越好。一般覆盖倍数达到一般覆盖倍数达到4-6倍覆盖率。倍覆盖率。 指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，一

14、条染色体或更小的区段（如一个一条染色体或更小的区段（如一个YAC或或BAC克隆克隆等）。等）。亚基因组文库亚基因组文库例如：将基因组DNA用多种限制性内切酶切割，Southern杂交显示目标基因在8.3kb的Spel片段上则可将Spel酶切的基因组DNA中的8.3kb片断回收，用于构建DNA文库。cDNA文库的构建文库的构建1、cDNA文库的特征文库的特征1）基因表达的时空性决定）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材，文库的取材， 构建构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。发育时期或这一时期的特殊组织。 根根 叶叶 花

15、花 花药花药 茎茎 穗下节穗下节 幼胚幼胚2）表达量的差异决定构建）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。文库要具有合适的容量。3)mRNA的丰度的丰度高丰度高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总多个拷贝，占总mRNA的的22% 中等丰度中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总个拷贝，占总mRNA的的49%低丰度低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总个拷贝，占总mRNA的的29%2、均一化、均一化cDNA文库文库 通过一定的策略和方法，将构建好的独立通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在

16、cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA文库称均一化文库称均一化cDNA文库。文库。Company name1. cDNA以以mRNA为模板逆转录出的为模板逆转录出的DNA称称cDNA。2. cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物利用某种生物的总利用某种生物的总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。

17、二、二、 cDNA文库的构建文库的构建Company name3. cDNA文库的特点文库的特点Company name（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。4. 构建cDNA文库的一般步骤（2）mRNA的分离纯化的分离纯化利用真核利用真核mRNA都含有一都含有一段段polyA尾巴，将尾巴，将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。 mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。Company nameCompany name反转录酶反转录酶 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆

18、转录酶能以RNA为模板合成为模板合成cDNA。 用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。的第一链。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物（3）cDNA的合成的合成Company name用碱处理或用用碱处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物或或RNaseH碱碱 降解降解mRNA模板模板Company name剩下的剩下的

19、cDNA单链的单链的3末端一般形成一个弯回来的双末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构，可成为合成第二条链发卡结构，可成为合成第二条cDNA链的引物。链的引物。用用DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链第一链5 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第二链合成第二链合成Company name核酸酶核酸酶S1用核酸酶用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）中有用的序列被切掉！）cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第一链第一链cDNA

20、第二链第二链5 3 5 3 去掉发卡结构去掉发卡结构Company name在双链在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的的3端分别加上几端分别加上几个个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶 cDNA与载体连接与载体连接Company nameCompany name一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时所时所需要的克隆数目。需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (

21、1- )p: 文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）: 某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n1n cDNA文库的大小文库的大小Company name获得目的基因的其他方法获得目的基因的其他方法 构建差示文库筛选特殊基因构建差示文库筛选特殊基因 差示文库（differential library）又称扣除文库（ subtracted library）, 是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。 mRNA差异显

22、示法获得目的基因差异显示法获得目的基因 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）PCR法全称为DD-PCR法其用途和应用目的与构建差示文库大体一致。 基因改造可获得新型目的基因基因改造可获得新型目的基因 采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使表达产物量提高或降低毒性，有助于研究基因间的相互作用（如协同抑制效应）。 Company name应用差别杂交或扣除杂交法 分离克隆的目的基因Company name差别杂交（differential hybridization） 又称差别筛选 (differential screening ) 适用于分离经特殊处理而

23、被诱发表达的mRNA的cDNA。 扣除杂交（subtractive hybridization ）又叫扣除cDNA克隆（ subtractive cDNA cloning） 通过构建扣除文库得以实现。Company name差别杂交： 需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。Company nameCompany name差别杂交的局限性： 1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显 2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交

24、信号不一致。Company name其它方法（用于基因分离和鉴定的辅助方法）其它方法（用于基因分离和鉴定的辅助方法） 1) 抑制消减杂交法（抑制消减杂交法（SSH, Suppression Substraction Hybridiazation) 该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的革命性方法，该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的革命性方法，特别适宜于那些差异表达量很低的基因，其富集效率在特别适宜于那些差异表达量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。需要倍以上。需要2g poly(A) RNA和化和化3-4天时间。天时间。主要步骤：主要步骤： i. 利用利用SMART或常规方法制备待测或

25、常规方法制备待测ts-cDNA（tester cDNA）和驱动和驱动ds-cDNA（driver cDNA） ii. 用限制酶用限制酶RsaI酶切酶切2种种cDNA，获得具有平端结构的，获得具有平端结构的ds-cDNA片段片段 iii. 将待测将待测cDNA样品分为两份，分别与样品分为两份，分别与2种不同的匹配接头种不同的匹配接头相相连接。两接头的连接。两接头的5端序列是相同的，而其端序列是相同的，而其3端则是不同的端则是不同的 Company nameiv. 每份待测每份待测cDNA样品中加入样品中加入过量的驱动过量的驱动cDNA，加热变性后再，加热变性后再复性，形成复性，形成a、b、c、d

26、 4种分子，种分子，a类分子包括等量的高丰度类分子包括等量的高丰度和低丰度序列。由于非目的和低丰度序列。由于非目的DNA已与驱动已与驱动cDNA形成了形成了c类分类分子而使差异表达的基因序列大大地富集了子而使差异表达的基因序列大大地富集了第第1轮轮PCR v. 将第将第1轮杂交的样品进行第轮杂交的样品进行第2轮杂交：将轮杂交：将2种样品混合后再加入种样品混合后再加入驱动驱动cDNA，被富集的，被富集的a类分子可形成类分子可形成b、c、e等等3类杂交分子，类杂交分子，e类分子是由类分子是由2个具有不同单链匹配接头的双链待测个具有不同单链匹配接头的双链待测cDNA组成，组成，该类分子是被大大富集了

27、的差异表达基因该类分子是被大大富集了的差异表达基因vi. 整个群体分子经过整个群体分子经过2轮轮PCR反应：补平末端和差异表达基因的反应：补平末端和差异表达基因的扩增扩增vii. 扩增结果扩增结果：a、c和和d分子因未形成双链或只有单端引物，而分子因未形成双链或只有单端引物，而b类分子可形成锅柄状分子，因而无法进行类分子可形成锅柄状分子，因而无法进行PCR扩增，只有扩增，只有e分分子才能被扩增子才能被扩增Company nameCompany name应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR） 分离克隆的目的基因 (differential display reverse transcrip

28、tion (differential display reverse transcription polymerase chain reaction)polymerase chain reaction)Company name原理： 用3 -端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3 -端锚定引物和5-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳23小时，可显示出50100条长度在1005000bp之间的DNA条带。Company name3 -锚定引物： P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA

29、，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5-T11MN或5-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。mRNA: 5-NMAAAAAAAA-3(12种序列) 3-NMTTTTTTTTT-5 Company nameCompany name5-随机引物： 10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20 000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型

30、细胞中所表达的全部的mRNA。Company name 第二节第二节 获得目的基因方法的选择获得目的基因方法的选择v 一、根据获得目的基因的研究目的选择方法v 为了研究基因全长结构、调控、DNA信息分析 构建基因组文库，v 为了开展目的基因重组表达 制药、治疗 构建cDNA文库。v 若目的基因序列明确可设计引物通过PCR/RT-PCR克隆。v 若目的基因序列短小可化学合成。v 二、根据目的基因本身特点选择方法v 对从基因组中克隆的基因(内含子) 只能真核表达v 对从cDNA中克隆的基因(无内含子) 可在原核/真核表达v 要选择mRNA表达丰富的组织材料，PCR克隆的基因必须测序。v 三、根据实

31、验室设备条件选择方法 v 部分文库无需自行构建，有商品出售。v 目的基因序列明确，也无需建库，可直接用PCR/RT-PCR克隆。Company name基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较Company name1、 cDNA文库以文库以mRNA为材料，特别适用于某些为材料，特别适用于某些RNA病病毒毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。2、 cDNA基因文库的筛选比较简单易行基因文库的筛选比较简单易行。他的文库所含的克隆数是基因文库的十分之一，或更少。3、由于每一个由于每一个cDNA克隆都含有一种克隆都含有一种mR

32、NA序列序列，这样，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低比较低，而相比，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。 cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在Company name4、 cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作直接应用于基因工程操作。原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经

33、过转录后得来的其内含子部分已被删除。5、 cDNA克隆还可以用于真核细胞克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和的结构和功能的研究功能的研究一种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定 cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在Company name1、受材料来源的影响 2、遗传信息量有限3、 构建的cDNA文库中高丰度的（含量） mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少 cDNA文库与基因组文库相比的缺点Company name第四章第四章 目的基因获取目的基因获取2. 构建基因组文库分

34、离法构建基因组文库分离法3. PCR分离法分离法4. 化学合成法化学合成法Company name 如果知道目的基因的全序列知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。省时省力第三节第三节 PCR扩增获得目的基因扩增获得目的基因Company name（1）提取基因组）提取基因组DNA作模板作模板（2）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增扩增真核生物基因组含有内含子！真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。适合扩增原核生物基因。1. 直接从基因组中扩增直接从基因组中扩增Company name原核

35、基因组部分原核基因组部分原核细胞原核细胞提取基因组提取基因组DNAPCR扩增扩增Company name（1）提取基因组）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总）反转录合成总cDNA作模板作模板（4）PCR扩增扩增（3）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾。尾。适合扩增真核生物基因。适合扩增真核生物基因。2. 从从mRNA中扩增中扩增: RT-PCRCompany name目的基因目的基因 的引物的引物1反转录成目的基因反转录成目的基因cDNA第一链第一链目的基因目的基因 的引物的引物2目的目的 基

36、因基因cDNA第二链第二链PCRmRNACompany name利用简并引物获取目的基因利用简并引物获取目的基因Company namev 一一 利用利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨编码的氨基酸序列基酸序列v 因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。v 二、对所找到的序列进行多序列比对二、对所找到的序列进行多序列比对v

37、将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析http:/ 。v 三、确定合适的保守区域三、确定合适的保守区域v 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50 400个aa为宜，使得pcr产物在1501200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个

38、aa且两者间距离合适的保守区域。 Company namev 四、利用软件设计引物四、利用软件设计引物v 当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中RAG，YCT，MAC，KGT，SCG，W AT，H ACT，B CGT，VACG， DA/G /T,N=ACG/T），该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的n

39、t区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 v 五、对引物的修饰五、对引物的修饰v 若得到的引物为：v 5-NAGSGNGCDTTANCADK-3v 则其简并度4243432=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。Company name值得注意的是值得注意的是常规PCR，可以合成的DNA片段长度有限，一般在1KB以内，

40、大于他扩增效果显著下降。？未知序列的DNA更长的DNACompany name特殊类型的PCR1、套式PCR（nested PCR） 利用两对引物，从一个模板的同一区域扩增出不同长度而设计的特殊方法。他较常规PCR灵敏度大大提高，同时也能有较强的特异性。2、不对称PCR利用引物浓度不同（50：1或100：1）-单链DNA，用作DNA序列分析的模板。3、反向PCR 未知序列的一种PCR方法Company name旁侧序列的克隆及测定旁侧序列的克隆及测定 v 反向PCR（Inverse PCR）v 温度非对称交互PCR（TAIL-PCR, thermal asymmetric interlaced

41、 PCR）v AL-PCR(adaptor ligation PCR）v T-Linker PCR(T-linker-specific ligation PCR）v SiteFinding-PCR Company name I-PCR是是1988年由年由Triglia最早提出的反向最早提出的反向PCR ( Inverse PCR , IPCR) 是最早提出的基于是最早提出的基于PCR 的染色体步行技术之一。的染色体步行技术之一。IPCR 的实验程的实验程序包括序包括,用限制性内切酶酶切用限制性内切酶酶切DNA ;酶切后的酶切后的DNA 片段用片段用T4 DNA连接酶连接酶进行自连接进行自连接,

42、产生环状产生环状DNA 片段片段;以环化产物为底物以环化产物为底物,用根据已知片段设计用根据已知片段设计的反向引物进行的反向引物进行PCR 扩增扩增,从而得到含有未知片段的扩增产物从而得到含有未知片段的扩增产物(图图1)Company nameTAIL-PCRv 在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成：(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物；(2)由同一特异性弓l物扩增出的产物；(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。 v TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特

43、异性引物(specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp)，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerate prime，AD，约14bp)相组合，以基因组DNA为模板根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物(流程如图所示)。 Company nameCompany nameCompany namev TAIL-PCR共分3次反应。v 第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特

44、异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物：特异性产物(I)型和非特异性产物(型和型)。v 第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。v 第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 Company namevSiteFinding-PCR: a simple and efficient PCR metho

45、d for chromosome walkingvNucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 13Company nameCompany nameCompany nameCompany nameCompany name第四章第四章 目的基因获取目的基因获取2. 构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法3. PCR分离法分离法4. 化学合成法化学合成法Company name1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的设想，并于合成基因的设想，并于1979年在年在science上上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基