第六章 诊断酶学

1、P136-1762教学目标教学目标 教学时数教学时数 6 6学时学时血清酶的分类、生理变异、病生机制血清酶的分类、生理变异、病生机制等，同工酶及其亚型测定，临床诊断中常用等，同工酶及其亚型测定，临床诊断中常用的血清酶及其同工酶，重要血清酶的测定、的血清酶及其同工酶，重要血清酶的测定、原理及评价原理及评价 。酶的有关酶基本知识，酶活性浓度的酶的有关酶基本知识，酶活性浓度的测定技术及酶的免疫化学测定测定技术及酶的免疫化学测定 。3 第一节第一节 血血 清清 酶酶 4一、血清酶的来源一、血清酶的来源 根据酶的来源及其在血浆中发挥催化根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，将其分为：功能的情况，将

2、其分为：P143一般代谢酶一般代谢酶组织专一酶组织专一酶血浆特异酶血浆特异酶非血浆特异酶非血浆特异酶 外分泌酶外分泌酶细胞酶细胞酶一般代谢酶一般代谢酶组织专一酶组织专一酶血浆特异酶血浆特异酶非血浆特异酶非血浆特异酶 外分泌酶外分泌酶细胞酶细胞酶血血 清清 酶酶5 名称名称 血浆特异酶血浆特异酶 非非血浆特异酶血浆特异酶 外分泌酶外分泌酶细胞酶细胞酶一般代谢酶一般代谢酶组织专一酶组织专一酶来源来源肝肝消化腺或其消化腺或其它外分泌腺它外分泌腺 各组织器官各组织器官 （无器官专（无器官专一性）一性） 肝肝 （有器官（有器官专一性）专一性） 种类种类凝血酶原、凝血酶原、因因子、子、因子、纤因子、纤溶酶

3、原、溶酶原、ChEChE、CERCER、LCATLCAT、脂、脂蛋白脂肪酶等蛋白脂肪酶等 胰淀粉酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等等LDH、AST、ALT、CK、MDH等等 OCT等等 6二、血清酶的去路二、血清酶的去路酶蛋白在血管内的失活与降解（主要代谢去路）酶蛋白在血管内的失活与降解（主要代谢去路）血清酶的半寿期（血清酶的半寿期（T1/2)：n酶失活至原来活性一半所需时间。酶失活至原来活性一半所需时间。n有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异。有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异。肝或网状内皮系统对血清酶的清除肝或网状内皮系统对血清酶的清除 少

4、数以酶原形式存在的血清酶类（凝血酶原、纤少数以酶原形式存在的血清酶类（凝血酶原、纤溶酶原）在活化后迅速被肝清除，网状内皮系统也可溶酶原）在活化后迅速被肝清除，网状内皮系统也可能参与血清酶（能参与血清酶（LD、AST、AMY、CK等）的清除。等）的清除。血清酶的排泄血清酶的排泄 尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途径，如胃尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途径，如胃蛋白酶原、淀粉酶（蛋白酶原、淀粉酶（AMY）。）。转入其它体液转入其它体液 只有血清酶的来源与去路保持平衡，才能维持酶只有血清酶的来源与去路保持平衡，才能维持酶活性保持相对恒定。但一些病理情况往往促使这种平活性保持相对恒定。但一些病理情况

5、往往促使这种平衡被打破，导致血清酶活性的变化。衡被打破，导致血清酶活性的变化。P1437三、血清酶变化的病理机制三、血清酶变化的病理机制（一）合成异常（一）合成异常合成减少合成减少合成增多合成增多肝损害导致合成酶的能力受损肝损害导致合成酶的能力受损（ChE、LCAT）酶基因变异引起酶合成减少酶基因变异引起酶合成减少（铜氧化酶）（铜氧化酶）增生性疾病（骨骼疾病，增生性疾病（骨骼疾病，ALP)恶性肿瘤（前列腺癌，恶性肿瘤（前列腺癌，ACP)酶的诱导作用（乙醇，酶的诱导作用（乙醇，-GT）P1448（二）释放增加（大多数血清酶增高的主要机制）（二）释放增加（大多数血清酶增高的主要机制）细胞内外酶浓度

6、的差异细胞内外酶浓度的差异 对于非血浆特异酶，细胞内外浓度差可在对于非血浆特异酶，细胞内外浓度差可在千倍以上，只要有少量细胞坏死或病变，血中千倍以上，只要有少量细胞坏死或病变，血中酶浓度明显升高。对血浆特异酶，细胞病变很酶浓度明显升高。对血浆特异酶，细胞病变很少引起血中酶浓度明显升高。少引起血中酶浓度明显升高。酶的相对分子量（影响细胞内释出的关键）酶的相对分子量（影响细胞内释出的关键） 酶从细胞内释出的速度与酶的相对分子量酶从细胞内释出的速度与酶的相对分子量成反比。如成反比。如AMI时，血中最先升高的是时，血中最先升高的是CK（MW：85kD)，LD （MW：125kD)出现升高出现升高明显延

7、迟。明显延迟。酶的组织分布酶的组织分布 含酶量高且血流丰富的组织器官，其细胞含酶量高且血流丰富的组织器官，其细胞内酶进入血流的可能性大；除少数组织专一性内酶进入血流的可能性大；除少数组织专一性酶以外，大多数血清酶不能特异反映某个特定酶以外，大多数血清酶不能特异反映某个特定组织的病变。但同工酶的发现大大提高酶检测组织的病变。但同工酶的发现大大提高酶检测的组织的特异性。的组织的特异性。酶在细胞内的定位及存在形式酶在细胞内的定位及存在形式 线粒体酶不易从细胞中释出，如线粒体酶不易从细胞中释出，如ASTm的的检测往往反映肝细胞的损伤程度，且是检测往往反映肝细胞的损伤程度，且是AMI中中最后升高的酶，用

8、于判断预后；有些酶在细胞最后升高的酶，用于判断预后；有些酶在细胞内与结构蛋白结合，较难释放。内与结构蛋白结合，较难释放。ATP ATP不足，细胞内酶容易释放。不足，细胞内酶容易释放。P1459（三）排出异常（三）排出异常肾功能减退，血清肾功能减退，血清AMY活性升高可能活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留。因酶排泄障碍而在血液中滞留。胆道梗阻，血清胆道梗阻，血清ALP升高的原因是梗升高的原因是梗阻区阻区ALP合成加强，合成加强，ALP排泄受阻而逆排泄受阻而逆流入血。流入血。大多数酶，不存在以上的清除机制。大多数酶，不存在以上的清除机制。P14510四、血清酶的生理差异四、血清酶的生理差异（一

9、）性（一）性 别别多数酶无差异，少数有差异多数酶无差异，少数有差异男性高于女性：男性高于女性： CKCK、ALPALP、 -GT女性高于男性：女性高于男性：LDH1LDH1（青年妇女）（青年妇女）（二）年（二）年 龄龄 最明显的例子是最明显的例子是ALPALP，新生儿血清中，新生儿血清中ALPALP略略高于成人，高于成人，1 15 5岁增至成人的岁增至成人的2 23 3倍，然后逐倍，然后逐渐下降，到渐下降，到10101515岁，岁，ALPALP又明显升高，可达又明显升高，可达成人的成人的3 35 5倍，倍，2020岁后降至成人值。岁后降至成人值。（三）饮（三）饮 食食 血清中大多数酶不受进食影

10、响，故测定酶血清中大多数酶不受进食影响，故测定酶活性不一定需要空腹采血。活性不一定需要空腹采血。（四）运（四）运 动动 激烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如激烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如CKCK、LDLD、ASTAST、ALDALD、ALTALT等活性升高。等活性升高。（五）妊（五）妊 娠娠（六）其（六）其 它它P14511第第 二二 节节 酶活性浓度的测定技术酶活性浓度的测定技术P146- P 16012酶活性浓度的测定技术酶活性浓度的测定技术酶活性浓度概念酶活性浓度概念酶活性浓度测定酶活性浓度测定连续监测法检测酶活性浓度连续监测法检测酶活性浓度工具酶工具酶血清酶活性浓度测定条件的优化血清

11、酶活性浓度测定条件的优化酶活性浓度的单位酶活性浓度的单位13一、酶活性浓度的概念一、酶活性浓度的概念1. 酶的特性：微量性酶的特性：微量性、高效性高效性等。等。直接测量非常困难直接测量非常困难（mmol/L或或mg/dl）通过测定被加速化学反通过测定被加速化学反应的反应速率，来间接应的反应速率，来间接反映酶的浓度反映酶的浓度2. 酶促反应酶促反应SSEE +ESEPE + PVdsdt或或VdpdtES14 3. 酶活性浓度酶活性浓度 即即酶所催化的化学反应的反应速率酶所催化的化学反应的反应速率，用用酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来计算。的

12、生成量来计算。注意注意：只有当酶所催化的反应速度仅与只有当酶所催化的反应速度仅与 E 成正比，而不受其它因素影响时，即在酶促成正比，而不受其它因素影响时，即在酶促反应的反应的零级期零级期，才能根据酶所催化的化学反才能根据酶所催化的化学反应速率来确切表示酶活性浓度的大小。应速率来确切表示酶活性浓度的大小。P14615 实际上是通过检测酶活性浓度间接反映酶的实际上是通过检测酶活性浓度间接反映酶的量，因为直接检测酶的质量浓度要求的实验条件量，因为直接检测酶的质量浓度要求的实验条件及技术条件非常高，价格昂贵，不适用于临床检及技术条件非常高，价格昂贵，不适用于临床检测，因此测定酶活性浓度是临床酶学分析最

13、为常测，因此测定酶活性浓度是临床酶学分析最为常见的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。见的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。 但仅在上述前提下，只能在反应的零级期，但仅在上述前提下，只能在反应的零级期，即只有在酶促反应的最适条件下，才能真实地代即只有在酶促反应的最适条件下，才能真实地代表酶含量。因此可根据酶促反应进程曲线，采用表酶含量。因此可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的检测。合理的方法进行酶活性浓度的检测。16零级零级一级一级PSV dpdt反应级数反应级数时间时间4. 酶促反应进程酶促反应进程延滞期延滞期线性期线性期非线性期非线性期P147 Lag phaseZer

14、o orderLinear phaseFirst order酶促反应时间进程曲线酶促反应时间进程曲线17单试剂测定体系酶促反应进程曲线单试剂测定体系酶促反应进程曲线P14818结论：结论： 为了计算酶活性浓度，必须根据线性为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（零级反应期）的反应速率才能准反应期（零级反应期）的反应速率才能准确计算出酶活性浓度否则将导致误差。确计算出酶活性浓度否则将导致误差。 酶活性浓度测定就是要使酶促反应酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度达到的初速度达到Vmax，即在过量底物存在，即在过量底物存在下的零级反应期的下的零级反应期的V，此时，此时V与与E之间有之间有线性关系。

15、线性关系。P14819二、酶活性浓度测定方法二、酶活性浓度测定方法（一）按检测方法分类（一）按检测方法分类1、量气法、量气法其原理是通过测量一封闭其原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的反应系统中气体变化后的气体体积或压力，从而计气体体积或压力，从而计算出气体的变化量算出气体的变化量适用于测定在反应中产生适用于测定在反应中产生或或 消耗气体的酶消耗气体的酶2、分光光度法、分光光度法酶促反应的底物与产物结酶促反应的底物与产物结构不同，光吸收谱也有差构不同，光吸收谱也有差异，不仅能在可见光范围异，不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度，还测定有色溶液的浓度，还能在紫外光波长范围测定能在紫外光波长

16、范围测定特异的带有双键或环状结特异的带有双键或环状结构的无色物质构的无色物质3、荧光法和放射性核素法、荧光法和放射性核素法通过荧光光度计测通过荧光光度计测定酶促反应生成荧定酶促反应生成荧光物质的速率，此光物质的速率，此速率与酶浓度成正速率与酶浓度成正比比4、其它方法、其它方法P14620（二）按反应时间分类（二）按反应时间分类1、定时法定时法（取样法、终点法、两点法）（取样法、终点法、两点法）优点：优点： 简单，测定时酶促反应已被终止，故比色计简单，测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择不考虑对酶活性的影响。不考虑对酶活性的

17、影响。缺点：缺点：无法知道无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。级反应。注意：注意：应先做预实验找出酶促反应速率恒定的时期，应先做预实验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间；保证酶和底物在所选定的温确定线性时间；保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要精确。度下作用时间要精确。P148 21 定时法定时法，早期测定酶活性浓度的方法，大多是，早期测定酶活性浓度的方法，大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的

18、生成量，计算酶促反应的平均速度。量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 连续监测法，连续监测法，即指连续测定酶促反应过程中某即指连续测定酶促反应过程中某一产物或底物浓度随时间变化的多点数据，求出酶一产物或底物浓度随时间变化的多点数据，求出酶促反应初速度，间接计算出酶活性浓度的方法。其促反应初速度，间接计算出酶活性浓度的方法。其是临床测定酶活性浓度最常用方法。是临床测定酶活性浓度最常用方法。222、连续监测法连续监测法（动力学法、速率法）（动力学法、速率法）优点：优点： 容易找到直线区域，选择线性反应期容易找到直线区域，选择线性反应期来计算酶活性，来计算酶活性，不需终止反应。不需终止反应。缺

19、点：缺点：线性反应期因酶种类和反应条件而异，线性反应期因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定，必须选取必须用实验方法进行确定，必须选取酶促反应的最适反应条件，需要有可酶促反应的最适反应条件，需要有可以连续监测的设备以连续监测的设备。P149 3、平衡法、平衡法 目前临床应用较少，通过测定酶促反应开目前临床应用较少，通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法。量来求出酶活性浓度的方法。23三、连续监测法测定酶活性浓度三、连续监测法测定酶活性浓度（一）种类（一）种类1.直接法直接法 不终止酶促反应条件下，直接通

20、过测定反应体系中底物不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化性质的变化（如：或产物理化性质的变化（如：A、荧光、旋光性，、荧光、旋光性，pH、电导、电导率、粘度等），从而计算出酶活性浓度。率、粘度等），从而计算出酶活性浓度。评价评价 方法简单，但只有底物与产物之间，在理化性质方面有方法简单，但只有底物与产物之间，在理化性质方面有显著性差异时，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直显著性差异时，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法测定。接法测定。P149 24（1） 目前以分光光度法最为广泛，目前以分光光度法最为广泛，利用利用340nm处吸光度的变化测定各种脱氢酶。处吸光

21、度的变化测定各种脱氢酶。NAD(P)+H+ NAD(P)H 仅在仅在260nm处有吸收峰处有吸收峰 在在260、340nm处有吸收峰处有吸收峰 340nm处处A的变化可以反映反应体系中的变化可以反映反应体系中NAD(P)H量量的增减，进而反映酶活性浓度。的增减，进而反映酶活性浓度。（2） 利用一类人工合成的所谓色原性底物，利用一类人工合成的所谓色原性底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物。其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物。P149 25（1）在原反应体系中加入一些试剂，其只和酶反应）在原反应体系中加入一些试剂，其只和酶反应物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和物迅

22、速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和酶反应，也不影响酶的活性。酶反应，也不影响酶的活性。S PE+ 试剂试剂可被检出的物质可被检出的物质（2）酶偶联法）酶偶联法 目前应用最多目前应用最多，即在原反应体系中，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。应偶联起来。P149 26（二）酶偶联反应（二）酶偶联反应 反应模式反应模式A B PExEi被测酶被测酶被测酶被测酶始发反应始发反应始发反应始发反应指示反应指示反应指示酶指示酶指示反应指示反应指示酶指示酶A B C P ExEaEi辅助酶辅助酶辅助反应辅助反应酶偶联体系酶

23、偶联体系辅助酶辅助酶辅助反应辅助反应P149 271. 酶偶联反应时相酶偶联反应时相 酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在几酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例，的检测为例，在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反应原理如下：在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反应原理如下：L-丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸 -丙酮酸丙酮酸 L-谷氨酸谷氨酸-丙酮酸丙酮酸NADH 乳酸乳酸NAD+ALTLDH 此时反应的方向由此时反应的方向由NADH转变为转变为NAD，随反应进行，随反应进行，A应随之而下降，通过检

24、测反应产物应随之而下降，通过检测反应产物A在在340nm处处A的变化速的变化速率，可以检测指示酶反应。率，可以检测指示酶反应。P150 ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺双试剂法测定中，首先使血清与缺少少-酮戊二酸的底物溶液混合，酮戊二酸的底物溶液混合，37C保保温温5m，将样品中所含的内源性，将样品中所含的内源性-酮酸消酮酸消耗完。然后再加入耗完。然后再加入-酮戊二酸启动酮戊二酸启动ALT催化的反应。催化的反应。28反应一开始加入的试剂反应一开始加入的试剂1中只有丙氨酸，不存在中只有丙氨酸，不存在-酮戊酮戊二酸，在此时相中，存在于样品中的干扰物质（内源性二酸，在此时相中，存在于样品中的干扰

25、物质（内源性-酮酸）消耗完。酮酸）消耗完。 加入试剂加入试剂2（即（即-酮酮戊二酸）启动反应，在戊二酸）启动反应，在初始阶段，产物初始阶段，产物-丙酮丙酮酸开始出现，并逐渐增酸开始出现，并逐渐增多，但处于较低水平，多，但处于较低水平，指示酶反应速度也较低，指示酶反应速度也较低，不能代表待测酶的不能代表待测酶的Vx。随着产物随着产物-丙酮酸增加到一丙酮酸增加到一定程度，定程度，Ex和和Ei反应反应V相同，相同，达到稳态期。此阶段达到稳态期。此阶段340nm处处A出现明显的线性变化。出现明显的线性变化。最后由于底最后由于底物的消耗，物的消耗，反应反应V逐渐减逐渐减慢，偏离线慢，偏离线性。性。P15

26、0 292. 酶偶联反应注意事项酶偶联反应注意事项(1)延滞期应越短越好，测定时间要避开此期。延滞期应越短越好，测定时间要避开此期。(2)(2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定，酶偶联不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定，酶偶联反应反应V V应超过或等于应超过或等于VxVx，Ei Ei反应必须是一级反应，即指示反应必须是一级反应，即指示酶反应速率和测定酶的产物酶反应速率和测定酶的产物B B浓度成正比。只有使用大量浓度成正比。只有使用大量的的Ei Ei及其及其KmKm值很小时才能做到。值很小时才能做到。(3)(3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格便宜的从经济方面考虑应选用一些来源容易且

27、价格便宜的酶（指示酶）制剂。酶（指示酶）制剂。(4)(4)适当的指示酶的用量，反复实验法确定，即做到酶适当的指示酶的用量，反复实验法确定，即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高，并在所选的最适条件偶联速率不随酶量的增加而升高，并在所选的最适条件下，指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。下，指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。P150 30（三）干扰因素（三）干扰因素(1)其他酶和物质的干扰其他酶和物质的干扰(2)酶的污染酶的污染(3)非酶反应非酶反应(4)分析容器的污染分析容器的污染(5)沉淀形成沉淀形成 解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正，另一个

28、有效途径就是不用单一试剂而改用校正，另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。双试剂测定酶活性。P151 31四、工具酶四、工具酶工具酶：酶学分析中作为试剂用于测定化工具酶：酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶。合物浓度或酶活性浓度的酶。指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。（一）工具酶（一）工具酶（二）常用工具酶（二）常用工具酶常用工具酶多为氧化还原酶类常用工具酶多为氧化还原酶类工具酶纯度不必要求过高工具酶纯度不必要求过高工具酶中杂质的含量有一定的限制工具酶中杂质的含量有一定的限制P152 32（三）工具酶参与的指示反应（三）工具

29、酶参与的指示反应 临床生化检验中，很多项目的测定往往使用有工具酶参与临床生化检验中，很多项目的测定往往使用有工具酶参与的类似的反应原理共通（通用）反应途径。的类似的反应原理共通（通用）反应途径。1. 偶联偶联H2O2的工具酶及其指示反应的工具酶及其指示反应葡萄糖葡萄糖尿酸尿酸胆固醇胆固醇甘油甘油丙酮酸丙酮酸葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶尿酸氧化酶胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶甘油氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以以H（e）为受体的指示酶）为受体的指示酶以以NAD(P)H为辅酶参与的指示酶为辅酶参与的指示酶触酶触酶POD(最常用）最常用）P152 2H2O2+4-AAP+酚酚 醌亚

30、胺醌亚胺(红色红色)+4H2OPOD33例：葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖例：葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖GluO2H2O GAH2O2H2O24-AAP酚酚 H2OO2红色醌类化合物红色醌类化合物GODPOD 葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）利用）利用O2和和H2O将将Glu氧化成氧化成GA，并释放，并释放H2O2 ，过氧化物酶（，过氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受体存在时将）在色原性氧受体存在时将H2O2分解为分解为H2O和和O2 ，并将，并将色原性氧受体色原性氧受体4-AAP和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即和酚去氢缩合为红色醌类化合物

31、，即Trinder反应。红色醌类化合物的量与反应。红色醌类化合物的量与Glu含量成正比。含量成正比。 即即POD催化下，催化下， H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色氧化芳香族胺色素原生成有色色素，此类色素原供氢体包括：素，此类色素原供氢体包括：OT、DAB、ODA、TMB。342. NAD(P)+或或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应偶联的脱氢酶及其指示反应 许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶如许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶如LD、GLD、G6PD等参与时，常将底物的等参与时，常将底物的H去除后传递给去除后传递给NAD (P)+形成形成NAD(P)H。借助。借助NAD(P)H340n

32、m处特征性的光吸收，借此用处特征性的光吸收，借此用分光光度法检测。分光光度法检测。 如：葡萄糖、尿素、如：葡萄糖、尿素、-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD等。等。例：例：尿素尿素H2O 2NH3CO2NH3 -酮戊二酸酮戊二酸 NADHH+ 谷氨酸谷氨酸NAD+H2O尿素酶尿素酶GLDP152 P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P) + 35五、血清酶活性浓度测定条件的优化五、血清酶活性浓度测定条件的优化方法方法仪器设备仪器设备试剂试剂自动生物化学分析仪参数设置自动生物化学分析仪参数设置标本的采集

33、、运输与保存标本的采集、运输与保存P153 36标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存溶血：细胞内酶而言，细胞内外浓度差异大；所以应及时溶血：细胞内酶而言，细胞内外浓度差异大；所以应及时进行分离，进行分离，静脉采血后应在静脉采血后应在12h内分离血清内分离血清。抗凝剂：利用草酸盐、枸橼酸盐、抗凝剂：利用草酸盐、枸橼酸盐、EDTA抗凝的血浆一般不抗凝的血浆一般不用作酶活性测定；肝素对用作酶活性测定；肝素对ALT、AST、CK、LD、ACP检测检测均无影响，可用于急诊；临床多用均无影响，可用于急诊；临床多用血清血清为首选测定标本。为首选测定标本。温度：大部分酶在低温中比较稳定，一般在血清分离

34、当天温度：大部分酶在低温中比较稳定，一般在血清分离当天测定，否则应放冰箱冷藏；测定，否则应放冰箱冷藏；通常在通常在04 C下使用、处理及下使用、处理及保存保存，除了一些冷变性的酶；液氮可作为酶学测定时血清标，除了一些冷变性的酶；液氮可作为酶学测定时血清标本及质控长期保存的方法。本及质控长期保存的方法。P155 37六、酶活性浓度单位六、酶活性浓度单位（一）酶活性单位（一）酶活性单位惯用单位惯用单位 用首先报告该种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名其用首先报告该种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名其单位，即使同一种酶因方法不同而有数种活性单位，参考值差单位，即使同一种酶因方法不同而有数种活性单位

35、，参考值差别很大。别很大。国际单位国际单位1963年，年，1IU1mol/min （25 C 及其他最适条件下）及其他最适条件下） 1976年，年， 1U1mol/min（特定条件下）（特定条件下） 1979年，年，1Katal1mol/s（规定条件下），（规定条件下），1U16.67nKatalP156 38（二）酶活性浓度单位（二）酶活性浓度单位以每单位体积所含的酶活性单位数表示；以每单位体积所含的酶活性单位数表示；各国学者习惯用各国学者习惯用U/L表示体液中酶催化活性浓度，表示体液中酶催化活性浓度， 1U/L=16.67nKatal/L 正常上限（正常上限（upper limits of

36、 normal，ULN）倍数）倍数 把酶测定值转换为正常上限值的倍数；把酶测定值转换为正常上限值的倍数；易于比较解释来自不同方法的结果，利于各实验室间质评调查；易于比较解释来自不同方法的结果，利于各实验室间质评调查；可将可将ULN进一步适当分级，制定出轻度、中度及重度增加的范围，进一步适当分级，制定出轻度、中度及重度增加的范围，使检测结果更加一目了然；使检测结果更加一目了然；P156 39（三）酶活性浓度计算（三）酶活性浓度计算 连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数（连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数（）。）。其定义为：特定条件下，一定波长的光，光径为其定义为：特定条件下，一

37、定波长的光，光径为1.0cm时，通过时，通过所含吸光物质的浓度为所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。时的吸光度。 连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化（连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化（A/min）U/LAminV106 v LA吸光度变化吸光度变化 106 把把mol换算成换算成mol v样品量样品量（ml） L 比色杯光径（比色杯光径（cm）V反应体系体积（反应体系体积（ml） 摩尔消光系数（摩尔消光系数（cm2 mol-1 ）P157 40 自动生物化学分析仪测定同一酶，条件固定时，自动生物化学分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上讲从理论上讲V，v和和

38、L均为固定值，均为固定值， 为常数，则可为常数，则可将公式简写为：将公式简写为： U/LAminKV106 v LK=K为酶活性浓度定量系数为酶活性浓度定量系数主要用于临床酶活性测定的计算与校正主要用于临床酶活性测定的计算与校正K值设置应考虑酶的参考值上限及测定时间两值设置应考虑酶的参考值上限及测定时间两方面，这些均与仪器测定的噪音有关。方面，这些均与仪器测定的噪音有关。P15841第第 三三 节节 酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定42一、报告方式一、报告方式酶活性浓度单位：酶活性浓度单位：U/L质量浓度单位：质量浓度单位：ng/ml， g/L二、优点二、优点灵敏度高灵敏度高特异性高特异性高能

39、用于检测一些不表现酶活性的酶蛋白能用于检测一些不表现酶活性的酶蛋白特别适用于同工酶的检测特别适用于同工酶的检测样品中其他方法不易测样品中其他方法不易测出的少量或痕量酶出的少量或痕量酶不受体液中其它物质的不受体液中其它物质的影响影响酶原或去辅基酶蛋白酶原或去辅基酶蛋白P160 43三、缺点三、缺点要制备足够量多的提纯酶作为抗原和具有要制备足够量多的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清免疫化学性质的抗血清步骤多，操作繁琐步骤多，操作繁琐测定成本高测定成本高P161 44第第 四四 节节 同工酶及其亚型测定同工酶及其亚型测定45一、概念一、概念同工酶（同工酶（isoenzyme） 同一种属中由不

40、同基因或等位基因所编码的多同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化功能，肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。亚型（亚型（isoform） 即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶，往往在基因编码产物所形成的多种形式的一类酶，往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。

41、P161 46二、分析方法二、分析方法 临床同工酶的分析可分为两步临床同工酶的分析可分为两步首先精确地分离出某酶的各同工酶组分首先精确地分离出某酶的各同工酶组分测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性P162 47二、分析方法二、分析方法（一）电泳法（一）电泳法原理原理使用最为广泛使用最为广泛简便、快速、分离效果好、不破坏酶的天然构象简便、快速、分离效果好、不破坏酶的天然构象可分为：乙酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电可分为：乙酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳测定步骤为：区带分离、活性显色和检测结

42、果测定步骤为：区带分离、活性显色和检测结果方法方法 同工酶氨基酸组成不同（一级结构不同），同工酶氨基酸组成不同（一级结构不同），pI不同，不同，电泳迁移率也就不同，电泳可将其分开。电泳迁移率也就不同，电泳可将其分开。P163 48显色染料显色染料偶氮染料偶氮染料四唑盐四唑盐 离子型化合物，易溶于水，离子型化合物，易溶于水，难溶于一般的有机试剂，利用其难溶于一般的有机试剂，利用其进行的偶合反应，生成不同颜色进行的偶合反应，生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测的偶氮色素进行同工酶谱检测 受氢体作用，四唑盐可被还原受氢体作用，四唑盐可被还原成紫红色的成紫红色的formazan，常用的有：，常用的有

43、：NBT、INT、MTT等。其中等。其中NBT使用最多。使用最多。扫描定量扫描定量光密度计光密度计荧光计荧光计P16349（二）色谱法（二）色谱法 柱色谱法柱色谱法离子交换色谱离子交换色谱亲和色谱亲和色谱商品化微型色谱柱商品化微型色谱柱P16450（三）免疫分析法（三）免疫分析法免疫抑制法免疫抑制法免疫沉淀法免疫沉淀法其它免疫学方法其它免疫学方法 利用同工酶利用同工酶的一种亚基与相的一种亚基与相应抗体结合后，应抗体结合后，酶活性受到抑制，酶活性受到抑制，测定加与不加抗测定加与不加抗体前后样品中酶体前后样品中酶活性的变化活性的变化 利用分离提纯的同工酶作抗原制备的利用分离提纯的同工酶作抗原制备的

44、抗体与含该型同工酶的待测样品混合，在抗体与含该型同工酶的待测样品混合，在一定条件下抗原抗体复合物形成沉淀，离一定条件下抗原抗体复合物形成沉淀，离心后测定上清液中其它型别的酶活性，将心后测定上清液中其它型别的酶活性，将加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。免疫电泳、免疫电泳、RIA、EIA和和CLIAP164 51（四）动力学分析法（四）动力学分析法 底物特异性分析法底物特异性分析法 抑制剂分析法抑制剂分析法 pH分析法分析法 热失活分析法热失活分析法（五）蛋白酶水解法（五）蛋白酶水解法P165

45、 52三、同工酶检测意义三、同工酶检测意义提高酶诊断的特异性提高酶诊断的特异性提高诊断的灵敏度提高诊断的灵敏度对某些疾病的预后有评价价值对某些疾病的预后有评价价值 有些同工酶有明显的组织有些同工酶有明显的组织分布和细胞内定位差异分布和细胞内定位差异 有些同工酶的变化可在总有些同工酶的变化可在总酶变化之前发生酶变化之前发生线粒体酶的测定线粒体酶的测定53第第 五节五节 临床常用血清酶分析临床常用血清酶分析 54一、转氨酶（一、转氨酶（ Aminotransferases ）及其同工酶）及其同工酶丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶 (Alanine aminotransferases，ALT) /

46、谷丙转氨酶谷丙转氨酶 GPT天冬氨酸氨基转移酶天冬氨酸氨基转移酶 (Aspartate aminotransferases，AST/ 谷草转氨酶谷草转氨酶 GOT1.催化反应催化反应L-丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸 -丙酮酸丙酮酸 L-谷氨酸谷氨酸L-天冬氨酸天冬氨酸-酮戊二酸酮戊二酸 -草酰乙酸草酰乙酸 L-谷氨酸谷氨酸ALTAST 两种酶均需要磷酸吡哆醛（两种酶均需要磷酸吡哆醛（VitB6）为辅基，不含）为辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白为脱辅基酶蛋白，无催化活性。磷酸吡哆醛的酶蛋白为脱辅基酶蛋白，无催化活性。P166 552.组织分布组织分布 ALT大量存在于肝组织大量存在于肝组织，其次为

47、肾、心、骨骼肌等。，其次为肾、心、骨骼肌等。其有两种活性同工酶，其有两种活性同工酶，(ALTs)、(ALTm)，分别存在细，分别存在细胞质及线粒体中。肝细胞中胞质及线粒体中。肝细胞中ALT大多存在细胞质，少量在大多存在细胞质，少量在线粒体，肝细胞坏死时血清中以线粒体，肝细胞坏死时血清中以ALTs为主。为主。 AST存在多种器官，按含量多少为存在多种器官，按含量多少为心心、肝、肝、骨骼肌和骨骼肌和肾。其有两种同工酶肾。其有两种同工酶ASTs、ASTm，分别存在细胞质及线，分别存在细胞质及线粒体中。细胞轻度损伤粒体中。细胞轻度损伤ASTs显著升高，而严重损伤时显著升高，而严重损伤时ASTm 大量出

48、现于血清中。血中大量出现于血清中。血中AST升高多来自心脏或肝升高多来自心脏或肝脏损伤。脏损伤。P166563.标本标本 溶血标本不能用于检测溶血标本不能用于检测 宜用血清，宜用血清，4 冰箱中可贮存冰箱中可贮存1星期，活性无明显改变。星期，活性无明显改变。4.临床意义临床意义 ALT是反映肝损伤的一个灵敏指标是反映肝损伤的一个灵敏指标 急性肝炎早期升高，急性肝炎早期升高，ALTAST； 急性肝炎恢复指标急性肝炎恢复指标 Deritis比值可用于肝炎诊断、鉴别诊断及判断转归比值可用于肝炎诊断、鉴别诊断及判断转归 酶胆分离是肝细胞坏死先兆酶胆分离是肝细胞坏死先兆P16757 AST主要用于肝脏疾

49、病的诊断主要用于肝脏疾病的诊断 AMI发病发病6-8h即升高，即升高，48-60h达高峰，达高峰，4-5d恢复正常。恢复正常。由于由于AST在在AMI时升高迟于时升高迟于CK，恢复早于，恢复早于LD，故目前诊，故目前诊断断AMI价值不大。价值不大。 急性肝炎，急性肝炎，AST升高程度不及升高程度不及ALT；慢性肝炎，特别肝；慢性肝炎，特别肝硬化、慢性活动性肝炎时，硬化、慢性活动性肝炎时，AST升高程度超过升高程度超过ALT。P167 58二、二、 -谷氨酰转移酶及其同工酶谷氨酰转移酶及其同工酶-谷氨酰转移酶谷氨酰转移酶 （ - glutamyl transpeptid, - GT/GGT） 1

50、. 催化反应催化反应又称：又称：-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶 （ -GTP/GGTP) 一种含巯基的线粒体酶一种含巯基的线粒体酶，可催化，可催化-谷氨酰基从谷氨酰基从GSH或其或其它含它含-谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基酸分子上。谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基酸分子上。 GSH氨基酸氨基酸 -谷氨酰氨基酸半胱氨酰甘氨酸谷氨酰氨基酸半胱氨酰甘氨酸GGTP167 59 2. 组织分布组织分布 肾脏中含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的肾脏中含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的GGT主要来自肝胆。主要来自肝胆。 3. 标本标本 GGT较稳定，室温下可放置较稳定，室温下可放置2d， 4可存放

51、可存放1w1w， -20可储存可储存1y1y；RBCRBC中几乎无中几乎无GGTGGT，因此溶血标本可以检，因此溶血标本可以检测。测。P167604. 临床意义临床意义 有助肝胆疾病的鉴别诊断有助肝胆疾病的鉴别诊断 与与ALP联合进行肝脏疾病检测联合进行肝脏疾病检测 胆道疾病，胆道疾病，GGT阳性阳性率高，而且升高明显，可高达率高，而且升高明显，可高达5-30ULN，肝实质疾病是，肝实质疾病是GGT一般只是中度升高，可达一般只是中度升高，可达2-5ULN。 若若ALP升高而升高而GGT正正常，则完全排除常，则完全排除ALP的肝的肝来源，若来源，若ALP和和GGT都增都增加，则应先排除肝外引起加

52、，则应先排除肝外引起GGT增加的原因，一旦排增加的原因，一旦排除，则除，则GGT增高为肝病所增高为肝病所致。致。(1) 肝胆疾病检出阳性率最高的酶肝胆疾病检出阳性率最高的酶 (2) 用于判断恶性肿瘤有无肝转移用于判断恶性肿瘤有无肝转移 (3) 乙醇、巴比妥类药物等可诱导乙醇、巴比妥类药物等可诱导GGT的升高。的升高。P168 61三、三、 肌酸激酶及其同工酶和亚型肌酸激酶及其同工酶和亚型肌酸激酶肌酸激酶 （creatine kinase，CK）1. 催化反应催化反应 CK催化肌酸和催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和或磷酸肌酸和ADP之间的磷酸转移之间的磷酸转移的可逆性反应，的可逆性反应，所产生的磷酸

53、肌酸含高能磷酸键，是肌肉收所产生的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。缩时能量的直接来源。 磷酸肌酸磷酸肌酸ADP 肌酸肌酸ATPCKP168622. 组织分布组织分布 广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。CK由两种不同亚基（由两种不同亚基（M，B）组成的二聚体，细胞质中存在）组成的二聚体，细胞质中存在三种同工酶：三种同工酶：CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、CK-MM(CK3)，线粒体中存在线粒体中存在CK-Mt(CK4)，其电泳速率最慢。，其电泳速率最慢。 CK同工酶又可分为不同亚型，同工酶又可分为不同

54、亚型，CK-MM有三种亚型，有三种亚型，CK-MM1，CK-MM2，CK-MM3，电泳速率依次减慢；，电泳速率依次减慢；CK-MB有有CK-MB2和和CK-MB1两种亚型。两种亚型。3. 标本标本 不得用溶血标本，不得用溶血标本，RBC中含有中含有AK，可干扰测定，可干扰测定，引起测定值偏高；测定样品宜用血清或肝素抗凝血浆，引起测定值偏高；测定样品宜用血清或肝素抗凝血浆，其它抗凝剂都抑制其它抗凝剂都抑制CK活性。活性。P168 63 4. 临床意义临床意义 CK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断。酶之一

55、，主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断。 (1) AMI的早期诊断的早期诊断总总CK在在AMI诊断中意义不大诊断中意义不大CK-MB为诊断为诊断AMI的金指标的金指标CK-MM3/CK-MM11.0为诊断为诊断AMI的标准（排除急性骨骼肌损伤）的标准（排除急性骨骼肌损伤）CK-MB21.9U/L或或CK-MB2/CK-MB11.5为诊断为诊断AMI的标准之一的标准之一 (2) 全身疾病特别是肌肉疾病时，全身疾病特别是肌肉疾病时，CK极度升高极度升高P169 64四、乳酸脱氢酶及其同工酶和亚型四、乳酸脱氢酶及其同工酶和亚型乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase，LD/L

56、DH） 1. 催化反应催化反应 LD催化乳酸氧化成丙酮酸，同时将氢转移给辅酶而成催化乳酸氧化成丙酮酸，同时将氢转移给辅酶而成为为NADH，依条件不同而有可逆性。，依条件不同而有可逆性。 L-乳酸乳酸NAD+ 丙酮酸丙酮酸NADHH+pH8.89.8Ph7.47.8P169 65 2. 组织分布组织分布 LD是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于人体各组织中，以是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、肝、心肌、肾、肌肉、RBC含量最高。含量最高。 LD是由两种不同亚基（是由两种不同亚基（M和和H）组成的四聚体，形成）组成的四聚体，形成5种结种结构不同的同工酶，即构不同的同工

57、酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和和LD5(M4)。 1.以以LD1为主，主要在心肌，可占总为主，主要在心肌，可占总LD活性活性50以上，以上，也存在于也存在于RBC内；内； 2.以以LD5为主，以横纹肌为代表，肝脏中也有；为主，以横纹肌为代表，肝脏中也有； 3.以以LD3为主，存在于脾肺。为主，存在于脾肺。 一般成年人血中一般成年人血中LD同工酶存在如下规律：同工酶存在如下规律：LD2LD1LD3LD4LD5，部分正常儿童血中可见，部分正常儿童血中可见LD1LD2。663. 标本标本 一般用血清，用血浆需离心去除血小板（血小板中含一般用血清，用血浆

58、需离心去除血小板（血小板中含有大量的有大量的LD），采血后迅速分离血清；因），采血后迅速分离血清；因RBC中中LD含量含量比血清高比血清高100倍以上，倍以上，不宜用溶血标本。不宜用溶血标本。 LD4、LD5宜冷变性，不应放在冰箱中宜冷变性，不应放在冰箱中，25 放放2-3d，LD活性变化不大。活性变化不大。674. 临床意义临床意义 亚急性心肌梗死诊断有一定价值，但其特异性差；亚急性心肌梗死诊断有一定价值，但其特异性差； (1) 诊断心脏疾病诊断心脏疾病 心肌梗死和心肌炎时以心肌梗死和心肌炎时以LD1和和LD2升高为主，大多升高为主，大多数数AMI患者血中会出现患者血中会出现“反转比率反转比

59、率”，即，即LD1LD2； (2) 诊断肝脏疾病诊断肝脏疾病 肝细胞损伤时常出现肝细胞损伤时常出现LD5LD4; 急性肝炎时急性肝炎时LD1LD2相对下降，相对下降，LD5升高；慢性肝升高；慢性肝炎时炎时LD5升高，且升高，且LD1LD3； (3) 诊断骨骼肌疾病诊断骨骼肌疾病 骨骼肌损伤时常出现骨骼肌损伤时常出现LD5LD4;P170 68五、碱性磷酸酶及其同工酶五、碱性磷酸酶及其同工酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP/AKP）1. 催化反应催化反应 一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（pH10.0）可以水）可以水解各种天然

60、及人工合成的磷酸单酯化合物。解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物。2. 组织分布组织分布 ALP广泛存在于各组织器官中，其含量以肝脏为最多，广泛存在于各组织器官中，其含量以肝脏为最多，其次为肾、胎盘、小肠和骨骼等。血清中的其次为肾、胎盘、小肠和骨骼等。血清中的ALP主要来自主要来自肝脏和骨骼。肝脏和骨骼。 生长期儿童血清内生长期儿童血清内ALP主要来自成骨母细胞和生长中主要来自成骨母细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。的骨软骨细胞，少量来自肝。P170 69 3. 标本标本 空腹采血空腹采血，避免脂肪餐的影响；样品用血清，避免脂肪餐的影响；样品用血清，不能用不能用明显溶血标本明显溶血标本；在