大鼠脑缺血再灌流后海马氨基酸水平变化与神经元损害的关系探讨

1、    大鼠脑缺血再灌流后海马氨基酸水平变化 与神经元损害的关系探讨        摘要目的探讨脑缺血再灌流后海马氨基酸递质变化与神经元损害的关系。方法建立大鼠前脑缺血再灌流模型，测定海马CA1区和CA3/齿状回区游离氨基酸含量，观察阻断隔-海马通路对海马神经元损害和氨基酸水平的影响。结果(1)海马结构中仅CA1区神经元明显损害，但CA1区和CA3/齿状回区的Glu、Asp和GABA含量无差异。(2)阻断隔-海马通路可明显减轻海马神经元损害，但对海马氨基酸水平变化无

2、影响。结论脑缺血再灌流后，氨基酸递质水平的异常变化不是海马CA1区神经元选择性易损的唯一决定因素，隔-海马通路末梢释放的神经递质也参与海马神经元损害过程。关键词脑缺血再灌流海马氨基酸隔-海马通路 Approach to the relationship between hippocampalamino acid levels and neuronal damage after forebrain ischemia/reperfusion in rats.Zheng Jian,Dong Weiwei,Zhao Shifu.Department of Neurology,Xinqiao Hospi

3、tal,Third Military Medical University,Chongqing 400037.AbstractObjectiveTo study the relationship between hippocampal amino acid levels and neuronal damage after cerebral ischemia/reperfusion.MethodsForebrain ischemia/reperfusion model was established in the rats.The contents of amino acids in the h

4、ippocampal CA1 subfield and CA3/dentate gyrus were measured.The effect of septo-hippocampal deafferentation to the hippocampal neuronal damage and amino acid levels was observed.Results1.The ischemic neuronal damage was observed only in the CA1 subfield among the hippocampal structures.The levels of

5、 Glu,Asp and GABA in CA1 subfield were not different from those in CA3ConclusionThe abnormal change of amino acid transmitter levels following cerebral ischemia is not the only factor that results in the selective vulnerability of CA1 neurons to ischemia.The neurotransmitters released from the septo

6、-hippocampal terminals during cerebral ischemia also take part in the hippocampal neuronal damage.Key wordsCerebral ischemia/reperfusionHippocampusAmino acidsSepto-hippocampal path海马结构是脑缺血后选择性易损部位，Kogure等1认为，脑缺血时传入海马的谷氨酸(Glu)能神经末梢大量释放的Glu对神经元产生兴奋性毒性，是造成海马神经元选择性易损的决定因素。然而，Buchan等2研究发现，事先阻断隔海马通路(主要含乙酰

7、胆碱，acetylcholine,Ach)也可减轻海马神经元缺血性损害，提示该通路末梢释放的神经递质的异常活动也参与神经元缺血性损害过程。为进一步探讨脑缺血再灌流后海马氨基酸递质变化与神经元损害的关系，本研究建立大鼠前脑缺血再灌流模型，观察了海马CA1区和CA3/齿状回区游离氨基酸水平变化，以及阻隔-海马通路对海马氨基酸水平和神经元缺血性损害的影响。1材料和方法1.1实验动物Wistar大鼠，雄性，230280g，共69只。本校实验动物中心提供。1.2前脑缺血再灌流模型参照Pulsinelli等3方法，阻断双侧椎动脉和颈总动脉血供，造成前脑缺血。20min后恢复脑血供。1.3切断隔-海马纤维参

8、照汪家政等4方法。固定动物于立体定位仪，开颅后用特制小刀横向切断左侧海马伞/穹窿。术后7d，对其中3只动物取脑冰冻切片，硫代胆碱铁氰化钾法做乙酰胆碱脂酶(acetylcholionesterase,AchE)染色，以确证阻断了隔-海马通路。1.4海马组织游离氨基酸测定按戴光明等5方法，大鼠前脑缺血再灌流后5min、30min、1h和2h，每一时点6只动物，取脑分离海马CA1区和CA3/齿状回区，分别称湿重，匀浆离心后取上清液，用氨基酸分析仪(Gold system-6300)测定氨基酸含量。6只假手术动物(除不夹闭颈总动脉外，余处理同脑缺血动物)取海马作氨基酸测定的对照。切断隔-海马纤维的动物

9、，术后7d前脑缺血再灌流，再灌流后5min和30min，每一时点6只动物，取脑分离左右侧海马，分别测定氨基酸含量。6只假手术动物作对照。1.5组织学观察6只动物前脑缺血再灌流后7d，取脑石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。6只切断隔-海马纤维的动物，术后7d前脑缺血再灌流，再灌流后7d取脑切片观察，计数CA1区存活神经元，并做左右比较。6只正常动物作对照。2结果2.1前脑缺血再灌流后海马CA1区和CA3/齿状回区氨基酸水平变化前脑缺血再灌流后各时点观察，海马Glu和天门冬氨酸(Asp)水平显著低于对照，而-氨基丁酸(-amino butyric acid,GABA)水平显著高于对照。海马CA1

10、区与CA3/齿状回区相比较，Glu、Asp和GABA水平均无显著差异(见表1)。表1大鼠前脑缺血再灌流后海马氨基酸含量(mol/g湿重，±s)CA1CA3/DGGluAspGABAGluAspGABA对照再灌流后5min30min1h2h8.69±0.327.62±0.35*7.52±0.28*8.05±0.12*8.11±0.20*2.20±0.161.46±0.09*1.50±0.14*1.82±0.11*1.90±0.12*1.61±0.112.76±0.18

11、*2.36±0.07*2.20±0.09*1.96±0.14*8.72±0.267.57±0.19*7.60±0.16*8.23±0.16*8.28±0.10*2.12±0.121.50±0.11*1.52±0.09*1.76±0.14*1.85±0.12*1.58±0.142.98±0.15*2.56±0.12*2.37±0.16*2.03±0.11*与假手术对照组比较*P<0.05,*P<0.01，每

12、组6只动物。组织学观察发现，前脑缺血20min后再灌流7d，海马CA1区神经元明显损害，锥体细胞数量减少。海马其余部位无明显病理改变。2.2阻断隔-海马通路对前脑缺血再灌流后海马神经元损害和氨基酸水平的影响切断左侧海马伞/穹窿后7d，对其中3只动物取脑做AchE染色，均观察到左侧海马较右侧海马明显淡染，仅轻度着色。表明阻断了左侧隔-海马胆碱能通路。切断左侧海马伞/穹窿后前脑缺血再灌流，7d后取脑切片，光镜下见双侧海马CA1区均有缺血性损害。左侧CA1区的损害比右侧明显较轻，存活神经数量较右侧显著多(每mm存活神经元数： 左侧89.33±10.61， 右侧13.50± 2.4

13、3,成对t检验，P<0.01)。切断左侧海马伞/穹窿后前脑缺血再灌流，左侧与右侧海马相比较，Glu、Asp和GABA的含量均无显著差异(见表2)。表2阻断隔-海马通路后海马氨基酸含量变化(mol/g湿重，±s)假手术对照再灌流后5min再灌流后30min左侧右侧左侧右侧GluAspGABA8.98±0.362.01±0.151.59±0.147.73±0.39*1.42±0.022.71±0.218.16±0.58*1.56±0.172.70±0.269.24±1.451.82&

14、#177;0.292.31±0.068.47±0.961.71±0.092.36±0.13与假手术组对照比较*P<0.05,P<0.01,每组6只动物。注：左侧为切断海马伞/穹窿侧。3讨论尽管早就发现，脑缺血再灌流后海马结构中CA1区神经元更易发生损害，却缺乏海马结构不同亚区氨基酸递质变化的比较研究报道。本实验观察到，大鼠前脑缺血再灌流后，海马CA1区和CA3/齿状回区氨基酸水平发生显著变化，但在再灌流后各时点的观察均未发现CA1区与CA3/齿状回区的Glu、Asp和GABA水平的变化存在差异。组织学观察发现，海马结构中仅CA1区发生明显损害

15、，其余部位(包括CA3/齿状回区)相对完整。上述结果表明，脑缺血再灌流后海马CA1区的选择性易损害与氨基酸递质水平变化有关外，尚有其它因素参与。本实验发现，事先阻断隔-海马通路可明显减轻海马神经元缺血性损害，但对海马Glu、Asp和GABA水平的变化无影响。表明阻断隔-海马通路后减轻海马神经元缺血性损害的作用不是通过影响海马氨基酸递质水平实现的。隔-海马通路主要含Ach能纤维。Kumagae等6观察到大鼠前脑缺血再灌流后海马细胞外液Ach浓度明显升高。我们以往也发现，脑缺血再灌流后海马结构AchE活性发生变化，尤以CA1区的改变最明显5，Ach能M受体拮抗剂阿托品可减轻海马神经元缺血性损害7。

16、结合上述研究结果，可认为脑缺血再灌流期间隔-海马通路末梢大量释放的Ach是造成海马神经元选择性易损的重要因素之一，确切的机制有待进一步阐明。作者单位：郑健赵士福400037重庆第三军医大学新桥医院神经内科董为伟重庆医科大学神经病研究所参考文献1 Kogure K.The mechanism of ischemia-induced brain cell injury:the membrance theory.Neurochemical pathology,1988,9:145.2 Buchan AM,Pulsinelli WA.Septo-hippocampal deafferentation protects CA1 neurons against ischemic injury.Brain Res,1990,512:7.3 Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke,1979,10:267.4 汪家政，柳川，华仲慰，等.大鼠隔-海马通路损伤对海马内递质含量及酶活力的影响.生理学报，1990，42：289.5 戴光明，郑健，张基谟，等.脑缺血/再灌注后大鼠海马GABA、AchE水平和迟发性