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文档简介

1、基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤1 材料（试剂和耗材）1.1 样本（小鼠组织）-2个1.2 引物（life technology公司合成）1.3 BestarTMqPCR RT Kit（德国DBI货号：DBI-2220）1.4 Bestar® SybrGreenqPCRmastermix（德国DBI货号：DBI-2043）1.5 96孔板（美国life technology）2 材料（仪器）2.1 ABI7500荧光定量PCR仪（life technology公司）2.2 TGL-16M低温冷冻离心机（湘仪）2.3 SW-CJ-1D单人净化工作台（泸净净化）2.4 HR40- A

2、2生物安全柜（Haier）3 实验步骤3.1 RNA的抽提RNA 的提取按life technology公司提供的Triozol RNA提取试剂盒的使用说明进行。程序如下：（1）将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol；（2）加入0.2mL氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀60s（请勿涡漩激烈振荡），室温静置3min，12,000g，4离心 15min，置于冰上；（3）溶液分为三层，RNA溶解在水相中，小心吸取 500l水相至另一个新的RNasefree的EP管中；（4）加入500l异丙醇，-20度放置1h，12,000g，4离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，

3、弃上清；（5）加入1ml 75乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；（6）超净工作台上吹干样品10min，加入适量DEPC水溶解RNA。加入40l DEPC水溶解沉淀。3.2 RNA质量检测紫外分光光度计测定RNA浓度：3.3去基因组DNA和cDNA的合成将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。把RNA在65°C条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。逆转录反应：5×RT BufferRT Enzyme MixPrimer MixRNARNase-free WaterToal反应条件：37

4、6;C, 15min98°C, 5min4°C,hold反应结束后，-20°C保存。 2L 0.5L 0.5L 6L 1L 10L3.4cDNA的实时荧光定量PCR 3.4.1实验步骤每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20L，根据表1.配置。反应条件为：95°C2min 95°C10s60°C34s（采集荧光信号） 72°C 30s循环结束后从60升高到98获取熔解曲线。45个循环3.4.2实验结果的分析方法本实验采用2-Ct法进行分析，计算公式为：F=2对照组目的基因对照组管家基因待测组目的基因待测组管家基因-（ - ） -（ - ）平均Ct值平均Ct值平均Ct值平均Ct值F为相对表达量，根据此次试验的设计，对照组中的目的基因表达量为1。4结果4.1 扩增曲线4.2 熔解曲线4.3实验数据见EXCEL表格。备注：Ct

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