霍乱弧菌致病因子诱导人肠上皮细胞炎症反应的实验研究

1、霍乱弧菌致病因子诱导人肠上皮细胞炎症反应的实验研究         11-03-24 10:13:00     作者：欧刚卫     编辑：studa20【摘要】  目的： 鉴定诱导人肠上皮细胞炎性反应的霍乱弧菌分泌产物。方法： 野生型霍乱弧菌O1株C6706及其变异株培养上清刺激极化的人单层肠上皮T84细胞体外模型上层腔面，分析细胞受刺激后通透性和细胞活性以及白细胞介素8(IL8)、肿瘤坏死因子(TNF)基因表达改变；分析上

2、清中霍乱弧菌蛋白酶(Vibrio cholerae protease,PrtV)和霍乱弧菌溶细胞素(Vibrio cholera cytolysin，VCC)含量以及溶血能力。结果： PrtV缺失株培养上清可引起T84细胞层的炎性反应，表现为通透性增加和IL8,TNF基因表达增加。肠上皮细胞炎性反应及红细胞溶血反应与VCC活性有关。结论： VCC是霍乱弧菌引起人肠上皮细胞炎性反应的主要因素，PrtV通过降解VCC而降低对肠上皮细胞的炎性反应。 【关键词】  霍乱弧菌蛋白酶； 霍乱弧菌溶细胞素； 人单层肠上皮细胞； 炎性反应AbstractObjective: To identify

3、the secreted component(s) of V.cholerae that induces an intestinal epithelial inflammatory response.  Methods： Culture supernatants of wild type Vibrio cholerae O1 strain C6706 and its derivates were analyzed for capacity to induce changes in cytokine mRNA expression levels, IL8 and TNF  s

4、ecretion, permeability and cell viability when added to the apical side of polarized tight monolayer T84 cells used as an in vitro model for human intestinal epithelium. Culture supernatants were also analyzed for PrtV and VCC content by immunoblot analyses and for hemolytic capacity.   Re

5、sults： Experiments with culture supernatants of different V.cholerae derivates suggested that VCC was capable of causing an inflammatory response characterized by increased permeability and production of IL8 and TNF  in tight monolayers. Capacity to induce this response in epithelial cells corr

6、elated to VCC content and hemolytic activity. Conclusion： The findings suggested that VCC induced the human intestinal epithelial inflammatory response. Furthermore, PrtV can mediate an environment dependent modulation of VCC induced inflammatory response.Key wordsVibrio cholerae protease;  Vib

7、rio cholera cytolysin;  human intestinal epithelial cells; inflammatory response     霍乱弧菌是霍乱的病原菌，人群通过摄入霍乱弧菌污染的水或食物引起腹泻性疾病。霍乱弧菌分泌的霍乱毒素(cholera toxin，CTX)是引起腹泻的主要因素。然而，大多数霍乱弧菌疫苗筛选菌株在临床实验中仍然表现出免疫反应性1，其作用的分子和细胞机理仍然不清楚。Levine等2发现一种先前未明确的肠道毒素在CTX缺失株可引起某些肠道症状，这些症状通常在CTX阳性菌株中被CTX引起的消化道症状

8、掩盖。这些肠道毒素可能是霍乱弧菌分泌的血液凝结蛋白酶(hemagglutinationprotease, Hap protease)3、多功能的RTX毒素(repeats in toxin)4和霍乱弧菌溶细胞素(Vibrio cholera cytolysin，VCC)5。    使用逆向分子遗传学方法，Vaitkevicius等6,7在霍乱弧菌O1株C6706发现霍乱弧菌蛋白酶(Vibrio cholerae protease, PrtV)与抗天然原生动物如鞭毛虫和纤毛虫的捕食有关。进一步研究发现，PrtV是霍乱弧菌定殖于美丽杆线虫（Caenorhabditis

9、 elegans，C.elegans）肠道并最后促使线虫死亡的必需因素。由此假设霍乱弧菌疫苗试验中志愿者肠道炎症反应可能是由霍乱弧菌蛋白酶PrtV引起的。然而，用人84肠道上皮细胞极化紧密单层细胞模型实验结果表明，PrtV不是肠道上皮细胞分泌白细胞介素8(interlukine8, IL8)的刺激因素，反而可降低由其他尚未明确的霍乱弧菌分泌因子引起的IL8表达6。为了进一步理解PrtV对于人和线虫肠道上皮细胞完全不同的作用，本文研究了霍乱弧菌分泌因子中引起人肠细胞炎性反应的成分及其相互关系。    1  材料与方法    1

10、.1  细菌菌株及培养    使用的细菌菌株见表1，所有细菌培养在20 ml含30 g/ml卡那霉素(kanamycin)LB培养基或含50 g/ml氨苄西林(ampicillin)脑心浸液(BHI)培养基，37 200 r/min振摇过夜，培养上清用无菌过滤器过滤。霍乱弧菌变异株构建按照文献8进行。表1  实验所用菌株，Tab 1  Bacterial strains（略）1.2  肠上皮单层细胞培养    参照文献9将人肠上皮T84细胞株培养在半透膜支持物上形成极化的人单层肠上皮细胞体外模型

11、。当模型跨上皮细胞膜电阻(transepithelial electrical resistance, TER)1 000 Ohm/cm2 时，用不同霍乱弧菌菌株培养上清替换上室细胞培养基。单层肠上皮细胞在含5%CO2，37细胞培养箱中继续培养5 h，测定TER后，收集下室培养液用于细胞因子蛋白质含量分析。收集细胞，用PBS清洗2次后保存于1 ml 含4 mol/L 异硫氰酸胍、25 mmol/L枸橼酸钠、0.5% N月桂酰基肌氨酸、0.1 mol/L 2巯基乙醇(pH 7.0)溶液中，用于RNA提取。    1.3  IL8和TNF mRNA水平的测定

12、    总RNA提取参照文献9用酸性异硫氰酸胍酚三氯甲烷法。提取的RNA溶解于含1 000 U/ml核酸酶抑制剂RNasin(Promega公司)的无核酸酶水中并保存于-80。    IL8和TNF mRNA含量用即时定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)法。并采用TaqMan EZ技术,以18S rRNA为标准对照。测定结果表示为每18S rRNA单位mRNA拷贝数。    1.4  IL8和TNF分泌量测定    使用人IL8和TNF酶联免疫吸附测定试剂盒分别测

13、定从单层细胞培养下室中收集的细胞培养液中IL8和TNF的含量。    1.5  溶血活性测定    参照文献10方法测定血红蛋白释放量确定溶血活性。8%兔红细胞悬浮于含0.1%明胶的PBS。50 l细胞悬液加到预先加入含50 l不同菌株过夜培养上清系列稀释液的96微孔板中，微孔板在37温育120 min，然后1 800 g离心10 min，分别从每孔中转移50  l上清到新的96微孔板中，用酶标仪在540 nm读取光密度值。    1.6  蛋白印迹分析VCC和PrtV含量    蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至二氟化树脂膜(PVDF)。用抗VCC和抗PrtV兔抗血清分别稀释110 000 和1200 000鉴定蛋白质。抗兔免疫球蛋白偶联的辣根过氧化物酶(HRP)为二抗，最终稀释度为120 000。电致发光和电化学发光系统用于检测化学发光水平，并用凝胶