抗VEGF165的嵌合抗体在小鼠骨髓瘤细胞中的表达

1、    抗VEGF165的嵌合抗体在 小鼠骨髓瘤细胞中的表达        摘要：目的减少鼠源性单抗的免疫原性，获得抗人血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165, VEGF165）的人/鼠嵌合抗体。方法将抗VEGF165鼠单抗VmD11的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH分别克隆到带有人IgG1轻链恒定区基因C，重链恒定区基因C1的真核表达载体pAcyc-neo-C和psv2-gpt-C1上，构建了真核

2、表达载体pAcyc-neo-C/hu和psv2-gpt-C1/hu,并应用脂质体转染的方法将其共同导入小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0中进行表达。结果转染后通过筛选培养获得了7个抗性细胞克隆，经亚克隆化培养得到4个稳定表达的阳性细胞株,ELISA检测到抗VEGF165人/鼠嵌合抗体表达，RT-PCR也证实了该嵌合抗体在mRNA水平上的表达。培养上清液中的抗体表达量约为10g/L，腹水中约为100g/L，经竞争ELISA实验和Western blot实验证实其具有与亲本鼠源单抗相同的VEGF165结合特性。结论成功的构建了能与VEGF165结合的人/鼠嵌合抗体。关键词：血管内皮细胞生长因子； 嵌合抗体；

3、基因工程抗体Construction and expression of a chimeric murine-human antibody against VEGF165GUO Wenzhong（Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021, P.R.China）YANG Zhihua（Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical Col

4、lege, Beijing 100021, P.R.China）RAN Yuliang, et al（Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021, P.R.China）Abstract：ObjectiveTo construct a chimeric murine-human antibody against VEGF165. MethodsThe murine genes encoding the variable regions of

5、light and heavy chains of monoclonal antibody VmD11 against VEGF165 were cloned into expressional vectors of pAcyc-neo-C and psv2-gpt-C1 separately. The resulted vectors were transferred into murine-myeloma-cells to express chimeric antibodies. The chimeric antibody in the cultural supernatant of tr

6、ansfected cells was detected by indirect ELISA and its humanized character and specificity against VEGF165 was confirmed by Western blot, RT-PCR and competitive ELISA. ResultsThe chimeric antibody against human VEGF165 was detected in the cultural supernatant of transfected myeloma cells with a yiel

7、d of 10g/L. Specificity of the chimeric antibody was proved by Western blot and competitive ELISA, the expression of chimeric gene was confirmed by RT-PCR. ConclusionChimeric mouse-human antibody against VEGF165 was successfully expressed in myeloma cells of mouse.Key words：Vascular endothelial grow

8、th factor; Chimeric antibodies; Engineering antibodies 近年来的研究表明，实体肿瘤的生长、复发和转移都与肿瘤血管形成密切相关1。血管形成受多种正负调节因子的调控，VEGF是目前发现的最重要的肿瘤血管形成促进因子之一，具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能2，在肿瘤的发展和转移中起着重要作用。以VEGF为靶，通过抑制或中和其活性，阻断肿瘤血管形成，从而可以防治肿瘤的复发和转移。VmD11是本室制备的抗人VEGF165鼠单抗。该单抗能中和VEGF165促血管通透性和血管形成的活性。在小鼠自发乳腺癌肺部转移实验动物模型中，能显著地抑制原发瘤的生

9、长和肺转移灶的形成，抑制率分别达83%和70.2%，显示出该单抗在临床治疗肿瘤中有着良好的应用前景。但鼠单抗应用于人体最大的障碍是引起人抗鼠抗体（HAMA）反应3，使鼠单抗体内半衰期明显缩短、疗效下降，甚至产生毒副作用。因此采用基因工程技术对鼠单抗进行人源化改造，避免产生或降低HAMA反应可以提高鼠单抗在临床治疗中的应用价值。人/鼠嵌合抗体保留了原鼠单抗的高亲和力，又使其在人体内的HAMA反应显著降低，更适合应用于临床治疗。本研究将鼠单抗VmD11的轻重链可变区基因克隆入带有人IgG1恒定区的真核表达载体，构建成功VmD11的人/鼠嵌合抗体基因，导入小鼠骨髓瘤细胞中进行表达，成功的表达了抗VE

10、GF人鼠嵌合抗体。材料与方法细胞系、质粒与抗体：小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0由本室保存。质粒pRGWL53和pRUWH58分别含有VmD11的轻、重链可变区基因（VL、VH），由本室构建。pAcyc-neo-C是带有人轻链恒定区的表达载体，psv2-gpt-C1是含人重链恒定区的表达载体，均由本室构建。VmD11是本室研制的抗VEGF165鼠单抗。工具酶及主要试剂：限制性内切酶、修饰酶购自Boehriger Mannheim公司，Taq+Pfu DNA聚合酶为生工公司产品。细胞培养试剂和MMLV反转录酶购自GIBCO BRL公司。所用抗体均购自Sigma公司。抗VEGF嵌合抗体表达载体的构建：以p

11、RGWL53和pRUWH58为模板，使用自己设计的引物P1、P2（轻链）和P3、P4（重链），采用PCR技术分别扩增出带有鼠基因组引导肽，5-端和3-端剪切位点序列的VmD11的VL和VH，产物以玻璃奶回收。VL片段补平后与经酶切后再补平的载体pAcyc-neo-C构建成轻链嵌合抗体基因的表达载体pAcyc-neo-C/hu。VH片段经酶切后与该酶切的载体psv2-gpt-C1构建成重链嵌合抗体基因的表达载体psv2-gpt-C1/hu。细胞培养与转染：接种适量Sp2/0细胞于培养瓶中，培养12 h后用纯化的载体pAcyc-neo-C/hu和psv2-gpt-C1/hu DNA,采用Lipof

12、ectAMINE试剂共转染，按试剂使用说明书进行。转染后的细胞采用含500g/ml的G418、50g/ml黄嘌呤、1g/ml霉酚酸的选择培养基进行筛选，3周后进行克隆化培养。RT-PCR检测嵌合抗体的表达：收集转染后的细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，以P1引物和人C 3端引物HK3进行PCR扩增轻链嵌合抗体基因，以P3引物和人C1重链CH1 3-端引物HG3进行PCR扩增重链嵌合抗体基因，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析（人C 3端引物HK3和人C1重链CH1 3-端引物HG3由海军总医院王琰教授惠赠，P1和P3引物是根据载体上的鼠引导肽序列自己设计的引物）。间接ELISA试验：以10g/m

13、l VEGF或羊抗人C多抗包被酶标板，加转染后细胞培养上清反应后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体（经鼠Ig吸附过）孵育，显色，测A490吸光值。Western blot实验：取2g VEGF165进行SDS-PAGE，转膜，加浓缩20倍的嵌合抗体培养上清和鼠单抗VmD11,孵育后，加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体反应后显色。竞争抑制试验：以2.5g/ml的VEGF165抗原包被酶标板。加入2.5ng/孔的原鼠单抗VmD11，或2.5ng/孔的VmD11与不同浓度的VEGF嵌合抗体。37孵育后再加入羊抗鼠IgG-HRP酶标抗体，反应后测A490值，并计算其竞争抑制率，同时设未

14、转染Sp2/0细胞培养上清及无关抗体人IgG1 对照。竞争抑制率按以下公式计算：结果1.VmD11嵌合抗体表达载体的构建：用P1和P2引物从pRGWL53上扩增出带有含内含子的鼠基因组引导肽和5-端，3-端剪切位点序列的VmD11的VL片段，大小约500bp；和用P3、P4引物从pRUWH58上扩增出带有含内含子的鼠基因组引导肽和5-端，3-端剪切位点序列的VH片段，大小约700bp，VL片段约500bp，连接入表达载体，经酶切鉴定后各分别从24个克隆中筛选到2个轻链和3个重链目的重组克隆，这些重组克隆分别含有VmD11轻、重链嵌合抗体表达载体。2.抗VEGF嵌合抗体基因在Sp2/0细胞中的表

15、达：各取5g轻、重链嵌合抗体基因表达载体共转染Sp2/0细胞，选择培养3 w后，换完全培养基培养1 w后可见克隆生长，共获得7个抗性克隆。收集培养上清，间接ELISA法测得上清中有抗人VEGF165嵌合抗体的表达。3次克隆化培养后获4个稳定表达的细胞株，以抗人C包板，人IgG1标准品作曲线，测得培养上清表达水平为10g/L，腹水中为约100g/L 。3.抗VEGF165人/鼠嵌合抗体人源性及抗原结合特异性的检测：(1) RT-PCR检测嵌合抗体在mRNA水平上的人源性及特异性：以转染后细胞的总RNA为模板进行RT-PCR反应，结果显示，采用扩增原鼠单抗VmD11可变区基因的引物，可扩增出特异的

16、320bp的VL和354bp的VH片段；采用人C轻链3-端引物HK3和鼠单抗VmD11 VL 5端引物，扩增出700bp左右的含有鼠单抗VmD11 VL和人C恒定区基因的轻链嵌合基因片段；用人C1重链CH1 3-端引物HG3与鼠单抗VmD11 VH的5端引物，可扩增出720bp大小的含鼠单抗VmD11 VH和人 C1恒定区基因的重链嵌合Fd基因片段（1）。这表明所表达的抗人VEGF165嵌合抗体在mRNA水平上含有人C轻链和人C1重链，具有人源性，并且含有原鼠单抗VmD11的可变区基因。1RT-PCR分析VEGF嵌合抗体的人源性Fig 1. Analysis of humanized char

17、acter of the chimeric antibody against VEGF165 by RT-PCR 1. DNA/Hind III molecular weight marker; 2. PCR product of the chimeric light chain gene; 3. PCR product of the chimeric heavy chain gene; 4. PCR product of VH gene of VmD11; 5. PCR product of VL gene of VmD11(2) 间接ELISA检测嵌合抗体的人源性：以羊抗人C多抗包被酶标板

18、，用HRP标记的羊抗人IgG Fc片段为二抗，进行间接ELISA试验。结果显示，未浓缩的培养上清中含有约10ng/ml的人IgG，这证明上清中所测得的抗体含有人抗体的恒定区片段，所表达的嵌合抗体的恒定区为人IgG的恒定区。(3) Western blot实验：人VEGF165抗原在SDS-PAGE转膜后，加入转染后浓缩的培养上清反应，再加羊抗人IgG Fc-HRP酶标抗体，可在相对分子质量43×103的VEGF抗原处显示特异染色带,在大于43×103处有一较弱染色带是未完全还原的VEGF多聚体染色带。原鼠单抗VmD11在加羊抗人IgG Fc-HRP酶标抗体时，在43

19、5;103的VEGF抗原处未见着色带(2）。这表明上清中的抗体是能与人VEGF165特异结合，也能与羊抗人IgG Fc结合的人/鼠嵌合抗体。2嵌合抗体的Western blot分析Fig 2. Western blot analysis of chimeric antibodyA: VmD11； B: Chimeric antibody(4) 竞争抑制ELISA分析嵌合抗体的抗原结合特异性：结果如表1，阴性对照人IgG1无关抗体与鼠单抗VmD11反应几乎无竞争抑制作用。VEGF165嵌合抗体在与鼠单抗VmD11的比例仅为0.51时，VmD11与抗原的结合即可发生明显的竞争抑制，随着嵌合抗体浓度

20、的增加，竞争抑制率增加，当比例为101时抑制率可达76%。这表明嵌合抗体和原鼠单抗VmD11与VEGF165抗原的相同表位结合，从而证明嵌合抗体VmD11与亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性。同时该结果还提示嵌合抗体与亲本鼠单抗有相似的亲和力。表1竞争抑制ELISA检测嵌合抗体的抗原特异性Table 1. Detection of specificity of the chimeric antibody against VEGF165 by competitive ELISASampleA490Inhibition ratePBS control0.004±0.003-The supe

21、rnatant of no transfected Sp2/00.005±0.005-2.5ng VmD11+25ng human IgG10.315±0.0154.83%2.5ng VmD110.331±0.0170.00%2.5ng VmD11+1.25ng the chimeric antibody0.201±0.02239.27%2.5ng VmD11+2.5ng the chimeric antibody0.187±0.02343.50%2.5ng VmD11+6.25ng the chimeric antibody0.157

22、7;0.01852.56%2.5ng VmD11+12.5ng the chimeric antibody0.097±0.01270.69%2.5ng VmD11+25ng the chimeric antibody0.080±0.03075.83%讨论 实体肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管的形成。近年来发展起来的以肿瘤血管为靶的抗肿瘤血管生成疗法，通过采用各种措施抑制肿瘤血管的形成，达到抑制肿瘤生长转移或缩小、消除肿瘤的目的，在动物试验中显示出良好的效果。VEGF是促进肿瘤血管生长的关键正调节因子之一，本室研制的抗VEGF165鼠单抗VmD11已被证明具有中和VEGF促血管

23、形成活性及抑制肿瘤生长转移的作用。本研究采用基因工程技术，在国内首次成功地构建并在小鼠骨髓瘤细胞中表达了抗VEGF165人/鼠嵌合抗体。该嵌合抗体的可变区来自VmD11，ELISA和Western blot证实该嵌合抗体能与VEGF165结合，这提示该嵌合抗体具有中和VEGF促血管形成活性及抑制肿瘤生长转移的作用。鼠单抗应用于人体的主要障碍是引起很强的HAMA反应，大幅度降低其疗效，而嵌合抗体免疫原性大大降低，可多次反复应用，因此VEGF嵌合抗体的研制成功将为临床治疗肿瘤提供一种新的手段。已有证据表明，杂交瘤内可存在假基因，同一单克隆杂交瘤内还可能存在多个抗体基因4，通过测序即可将它们鉴别出来

24、。然而有研究发现，经测序已分析鉴定为功能性抗体可变区基因，但其表达产物却没有结合抗原的活性。进一步的研究证实，在克隆过程中扩增引物可能改变抗体可变区基因两侧的氨基酸序列，这些改变可能导致抗体亲和力的大幅度下降5。因而，仅通过测序不能最后确定所获的抗体基因为功能性抗体可变区基因，只有当基因表达后，并证明其产物具有原抗体的抗原结合活性，才能最终确定所获的是功能性抗体可变区基因。本试验中的嵌合抗体能与VEGF165结合，表明所获VmD11抗体可变区基因为功能性抗体可变区基因。应用该基因我们已表达出具有VEGF结合活性的抗VEGF单链抗体(另文发表)。Sp2/0细胞作为小鼠骨髓瘤细胞自身不能合成免疫球蛋白，但是由于其能对转入的免疫球蛋白基因的表达产物进行最佳修饰，因此是表达功能性免疫球蛋白的良好宿主，而且Sp2/0细胞分裂快，易培养，可接种小鼠腹腔生产抗体。但目前VEGF嵌合抗体在Sp2/0细胞中的表达水平很低,达不到工业生产的要求，要使VEGF嵌合抗体最终用于临床治疗肿瘤，必须大幅度提高嵌合抗体的表达产量。目前我们正在进行真核高效表达的研究，并已取得突破性进展。基金项目：国家863资助项目(863-102-09)作