Percoll细胞分离液说明书(GE法玛西亚)(一)原理Percoll是一种包有...

1、Percoll 细胞分离液说明书（GE 法玛西亚）（一）原理Percoll 是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低（ <20mosm kg H O） , 粘度也很小， 可形成高达 1.3g ml 密度， 采用预先形成的密度梯度时可在低离心力 （ 2001000g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。 由于 Percoll 扩散常数低， 所形成的梯度十分稳定。此外， Percoll 不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。二）操作方法及注意事项1. 不同浓度（密度）Percoll溶液的制备 :先用 9

2、份 Percoll 与 1份 8.5 NaCl 或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85 NaCl 或 0.15M PBS）稀释到所需浓度。Percoll浓度（）706050403020比重 gml1.0901.0771.0671.0561.0431.0312. 不连续密度梯度 Percoll 层的制备 : 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的 Percoll 液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层 Percoll 比重相差不大时，可将 Percoll 液放入注射器中，小针头斜面紧

3、贴管壁，任其自然慢慢流下。3. 装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。4. 离心：一般采用离心力为 400g，时间 20 25min。由于多层 Percoll 之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。5. 取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除 Percoll 液后收集界面部位的细胞; 有时大部分细胞位于Percoll层中, 则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2 次洗涤后可供培养或检测用。（三）分离纯化细胞举例1. 富含 NK 活性大颗粒淋巴细胞（ LGL）的纯化 : 按顺序

4、由下向上逐层加 50、47.5 、 45、 42.5 和 40 五种不同密度的 Percoll, 如用 10ml 试管（或塑料管）分离 , 每层 Percoll 约 1.2 1.5ml ，初步从外周血中分离的 PBMC细胞 1×10悬于 ml 培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含 NK 杀伤活性的LGL细胞位于42.5 与 45Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加 50和 30 Percoll 液。收取经 PHA（或其它抗原、有丝分裂原）刺激 PBMC,或含有较高比例异型的 PBMC（如肾综合征出血热患者），按要求装样、离

5、心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞； 两层 Percoll 之间为淋巴母细胞， 纯度和回收率在 80以上，位于 30Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。（四）人不同血细胞的漂浮密度表人不同血细胞的漂浮密度细 胞漂浮密度 细 胞漂浮密度红细胞1.09-1.11淋巴细胞1.052-1.077粒细胞 B 淋巴细胞1.062-1.075嗜酸性1.09-1.095 T 淋巴细胞1.065-1.077嗜中性1.080-1.085 淋巴母细胞1.065-1.077单核细胞1.050-1.066自然杀伤细胞1.050-1.070血小板1.030-1.060（五）问与

6、答问：请问 percoll 连续梯度怎么配制？比如15% -75% 的 percoll 连续梯度 ?答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用 80 配的，不一定的。另外， percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9 份 Percoll 与 1 份 8.5 NaCl 或 1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85 NaCl或 0.15M PBS ）稀释到所需浓度。即取 Percoll原液与 10 倍浓缩的 PBS 以 9： 1 的比例混合，此时溶液为 100 Percoll