组织分离和孢子分离

1、实验四实验四 食用菌的组织分离与孢子食用菌的组织分离与孢子分离分离一一 实验目的实验目的 1 学习、掌握食用菌组织分离和孢子分离的原理与学习、掌握食用菌组织分离和孢子分离的原理与操作方法；操作方法； 2 了解组织分离和孢子分离的特点和实际意义。了解组织分离和孢子分离的特点和实际意义。 二二 实验原理实验原理 通过无菌手段将某种食用菌从混杂的通过无菌手段将某种食用菌从混杂的微生物群微生物群体体中分离培养，获得纯菌丝体的方法称为中分离培养，获得纯菌丝体的方法称为菌种分离菌种分离。分离所得的纯菌丝体即为原始母种分离所得的纯菌丝体即为原始母种。依据分离材料。依据分离材料的不同，菌种分离可分为的不同，菌

2、种分离可分为孢子分离孢子分离、组织分离组织分离和和基基内菌丝分离内菌丝分离。 1 1 组织分离组织分离 是在双核菌丝双核菌丝的组织体上切取小块组织进行分离培养，从而获得纯菌丝体的方法，属于无性繁殖无性繁殖。其主要特点特点：取：取材广泛，操作简便，分离成功率高。材广泛，操作简便，分离成功率高。 食用菌的子实体子实体、菌核菌核、菌索菌索等都是由双核菌丝扭结发育形成的特殊组织，具有亲本的全部遗传信息和较强的再生具有亲本的全部遗传信息和较强的再生能力能力，利用此特点，将小块组织转接到合适的培养基上，在适宜的条件下培养即可长出保持亲本性状的新生菌丝。新生新生菌丝经出菇实验证明性状良好便可作为母种使用。菌

3、丝经出菇实验证明性状良好便可作为母种使用。此法常用于菌种的自然选育，复壮，以及优良菌种的保存。菌种的自然选育，复壮，以及优良菌种的保存。 2 2 孢子分离孢子分离 是利用食用菌是利用食用菌成熟的有性孢子成熟的有性孢子萌发形成菌丝体来获得纯萌发形成菌丝体来获得纯菌种的方法；根据接入培养基的孢子数量可分为菌种的方法；根据接入培养基的孢子数量可分为单孢分离单孢分离和和多孢分离多孢分离。孢子分离的主要特点有：。孢子分离的主要特点有： 有性孢子具有双亲的遗传特性，变异性大，可供选育有性孢子具有双亲的遗传特性，变异性大，可供选育新菌株和杂交育种；新菌株和杂交育种； 孢子的生命力强，所得菌种菌龄小，有活力，

4、可用作孢子的生命力强，所得菌种菌龄小，有活力，可用作菌种复壮；菌种复壮； 过程繁琐，工作量大，且单孢分离会出现许多无效组过程繁琐，工作量大，且单孢分离会出现许多无效组合。合。 单孢分离单孢分离 是将采集到的大量孢子通过稀释相互分开，再是将采集到的大量孢子通过稀释相互分开，再经培养使各孢子单独萌发获得纯种经培养使各孢子单独萌发获得纯种。多用于菌株的。多用于菌株的筛选和杂交育种，在生产上只能用于筛选和杂交育种，在生产上只能用于同宗同宗结合的食结合的食用菌类（如草菇、双孢蘑菇）。单孢子分离的方法用菌类（如草菇、双孢蘑菇）。单孢子分离的方法有多种，使用单孢分离器最可靠，但操作较复杂；有多种，使用单孢分

5、离器最可靠，但操作较复杂；另外，常用的操作相对简单、成功率较高的方法还另外，常用的操作相对简单、成功率较高的方法还有有稀释分离法稀释分离法、毛细管法毛细管法和和平板划线分离法平板划线分离法。本次本次实验采用稀释分离法，将孢子稀释至实验采用稀释分离法，将孢子稀释至50100个个/mL涂平板。涂平板。多孢分离多孢分离 是将多个孢子多个孢子接种于同一培养基，使其萌发、自由交配而获得纯菌种。常用斜面划线法和涂布分离法，斜面划线法和涂布分离法，在食用菌制种中应用较普遍，生产上多用于异宗异宗结合的食用菌来获得结实性菌种。获得结实性菌种。 种菇的选择种菇的选择 选择采集孢子的种菇要求是选择采集孢子的种菇要求

6、是在适宜的出菇期出菇早、特在适宜的出菇期出菇早、特征典型、生长健壮、成熟度适宜的第一、二潮优良子实体征典型、生长健壮、成熟度适宜的第一、二潮优良子实体。如香菇、草菇等选用菌膜将破未破的子实体，而平菇之类的如香菇、草菇等选用菌膜将破未破的子实体，而平菇之类的则选用八九成熟、即将释放孢子的子实体。则选用八九成熟、即将释放孢子的子实体。孢子的采集孢子的采集 采集方法有整菇插种法、三角瓶钩采集方法有整菇插种法、三角瓶钩悬法、菌褶涂抹法、印模法等。悬法、菌褶涂抹法、印模法等。本实验本实验采用采用整菇插种法整菇插种法（香菇），（香菇），将种菇在无将种菇在无菌操作下插入孢子收集器内，置室温下菌操作下插入孢子

7、收集器内，置室温下让孢子自然弹射。让孢子自然弹射。 三三 实验器材实验器材 孢子收集器：玻璃罩（顶部有孔）或类似物，孢子收集器：玻璃罩（顶部有孔）或类似物，搪瓷盘，培养皿，支架（钨丝或铁丝绕成），纱搪瓷盘，培养皿，支架（钨丝或铁丝绕成），纱布；（以上物品均已灭菌）布；（以上物品均已灭菌） 恒温培养箱，超净工作台，解剖刀，酒精棉恒温培养箱，超净工作台，解剖刀，酒精棉球，镊子，接种环，球，镊子，接种环，200uL和和1000 uL枪及灭菌枪及灭菌枪头，涂布棒，无菌水，血球计数板，显微镜，枪头，涂布棒，无菌水，血球计数板，显微镜，无菌的无菌的EP管，电炉，无菌培养皿管，电炉，无菌培养皿2个个/人，人

8、，PDA斜斜面面1支支/人；人； 种菇（香菇）种菇（香菇）1-2个个/组；组； 四四 实验操作实验操作 1 倒平板倒平板 将将PDA培养基在电炉上融化，待不烫手时于无培养基在电炉上融化，待不烫手时于无菌操作台上倒平板，凝固；菌操作台上倒平板，凝固； 2 香菇的单孢分离香菇的单孢分离 将预先收集的孢子配成孢子悬液，用血球计数板计数并进将预先收集的孢子配成孢子悬液，用血球计数板计数并进行适当稀释使孢子数量为行适当稀释使孢子数量为50-100个个/mL，然后吸取，然后吸取0.2mL稀释好的孢子液涂布平板（每人一个），适温培养稀释好的孢子液涂布平板（每人一个），适温培养（25）；）； 3 香菇的多孢分

9、离香菇的多孢分离 超净工作台中，将种菇表面用酒精棉擦拭超净工作台中，将种菇表面用酒精棉擦拭 用消毒的镊子用消毒的镊子挑破菌膜（或直接撕掉）挑破菌膜（或直接撕掉）将灼烧后将灼烧后冷却冷却的接种环插入菌的接种环插入菌褶间隙中蘸取孢子褶间隙中蘸取孢子 划斜面划斜面 （每人一支）（每人一支） 适温培养（适温培养（25） 4 香菇组织分离香菇组织分离 在超净工作台上将用于组织分离的菇体表面消毒在超净工作台上将用于组织分离的菇体表面消毒 去掉菌柄去掉菌柄 从从菌柄与菌盖的接触处菌柄与菌盖的接触处将香菇菌盖扳开将香菇菌盖扳开 将解剖刀用棉球擦拭后在酒精灯上过火，冷却将解剖刀用棉球擦拭后在酒精灯上过火，冷却

10、取取绿豆粒绿豆粒大小的菌肉组织（菌柄与菌盖交界处的）大小的菌肉组织（菌柄与菌盖交界处的）3块，用无菌镊子放入培养皿的平板培养基表面块，用无菌镊子放入培养皿的平板培养基表面（呈三角分布）（呈三角分布） 适温下培养（适温下培养（24） 五五 实验结果实验结果 1 孢子分离：孢子分离： 一般一般5d左右左右可见到孢子萌发出的可见到孢子萌发出的星芒星芒状状菌落。若作为菌种保藏或用于生产，则需进一步菌落。若作为菌种保藏或用于生产，则需进一步镜检、移接培养；对于异宗结合的单核菌丝需进行镜检、移接培养；对于异宗结合的单核菌丝需进行配对杂交配对杂交;对于同宗结合的则可直接获得纯菌种。对于同宗结合的则可直接获得

11、纯菌种。 如果培养基表面过早的出现菌落，很可能是杂菌。如果培养基表面过早的出现菌落，很可能是杂菌。 2 组织分离组织分离: 2-3d组织块上即可萌发大量菌丝，此后组织块上即可萌发大量菌丝，此后每每2-3d检查一次污染情况。一般检查一次污染情况。一般8-10d菌丝长满斜菌丝长满斜面面，可直接作为母种使用。，可直接作为母种使用。 香菇组织（子实体）分离：香菇组织（子实体）分离：5d结果（结果（04级）级）香菇组织（子实体）分离：香菇组织（子实体）分离：7d结果（结果（05级）级）香菇单孢子分离：香菇单孢子分离：7d结果（结果（04级）级）香菇多孢分离：香菇多孢分离：7d结果（结果（04级），上方试管斜面污染杂菌级），上方试管斜面污染杂菌六六 思考题思考题 1 组织分离和孢子分离各有哪些优缺点？组织分离和孢子分离各有哪些优缺点？ 2 结合其优缺点谈谈食用菌组织分离和孢子分离在结合其优缺点谈谈食用菌组织分离和孢子分离在实际生产和研究中有哪些意义？实际生产和研究中有哪些意义？ 3 讨