氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响

1、                 作者：杨华 余加林 刘官信 陈波曼【摘要】  目的 研究氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响。方法 孔径为0.22m的医用微孔滤膜建立铜绿假单胞菌生物膜的体外模型；用高效液相色谱(HPLC)方法测定环丙沙星透过生物膜的量，并测定在2和0.75mg/ml氨溴索作用后环丙沙星透过细菌生物膜的量。结果 经过7d的连续培养后，铜绿假单胞菌可在微孔滤膜上形成均匀致密的生物膜。环丙沙星可缓慢透过细

2、菌生物膜，8h左右达到平衡；2和0.75mg/ml氨溴索作用后可以明显增加环丙沙星8h内透过生物膜的量。结论 以医用微孔滤膜为载体可建立铜绿假单胞菌生物被膜体外模型；氨溴索可以显著地促进环丙沙星对细菌生物膜的透过。 【关键词】  细菌生物膜 环丙沙星 氨溴索 铜绿假单胞菌 渗透限制    Effect of ambroxol on permeability of ciprofloxacin across      ABSTRACT  Objective  To investigate

3、the effect of ambroxol on the permeability of ciprofloxacin across the bacterial biofilm of Pseudomonas aeruginosa.  Methods  In vitro model of P.aeruginosa biofim using 0.22m pore diameter medical micropore film was established. The amounts of ciprofloxacin across the bacterial biofilm wa

4、s measured by HPLC under different circumstances: physiological saline, 2mg/ml and 0.75mg/ml ambroxol, and clarithromycin was used as positive control.  Results  After continuous sevenday cultivation, P.aeruginosa could form compact and welldistributed biofilm on the surface of micropore f

5、ilm. Ciprofloxacin could slowly permeate through the biofilm and equilibration was achieved in 8h. When combined with ambroxol, the permeability rate of ciprofloxacin significantly increased.  Conclusions  In vitro model of P.aeruginosa biofilm was successfully established using medical mi

6、cropore film as a supporter, and ambroxol can significantly promote the permeability of ciprofloxacin across the bacterial biofilm of Pseudomonas aeruginosa.    KEY WORDS  Bacterial biofilm;  Ciprofloxacin;  Ambroxol;  Pseudomonas aeruginosa;  Penetration limi

7、tation   细菌生物膜(biofilm，BF)是一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体，BF菌生物学特性与浮游菌显著不同，其环境适应能力更强，可抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，故耐药性极强，使BF相关感染的临床治疗变得非常棘手。在BF细菌的耐药机制中，渗透限制显得尤为重要。由于BF的特殊结构，使抗生素难以渗透， 导致只有BF表面的细菌暴露于有效剂量的抗生素中，而BF深层的细菌难以被杀灭，这也是临床上BF感染难以治愈或迁延反复的原因之一。国外有报道，化痰药N乙酰半胱氨酸干扰生物膜形成，破坏生BF结构的作用1，被认为是一种具有抗菌性质的非抗生素药物。氨溴索(商品名：

8、沐舒坦)是临床治疗中常用的化痰药物之一，与N乙酰半胱氨酸作用机制上有一定的相似性，但它是否具有破坏BF结构，增加药物渗透的作用还不确切。本实验在建立体外BF模型的基础上，探讨氨溴索对喹诺酮类抗生素环丙沙星透过BF的影响，为临床上选择氨溴索作为抗生素治疗的辅助药物提供实验依据。    1  材料    1.1  药物    氨溴索标准品(批号20051011)、盐酸环丙沙星标准品(批号30451200302)和克拉霉素标准品(批号20040613)均由中国药品生物制品检定所提供。

9、0;   1.2  BF载体及模型材料    0.22m的医用微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)，直径1cm高1.3cm的玻管(重庆医药集团股份有限公司订做)。    1.3  受试菌株    铜绿假单胞菌PAO1菌株为本实验室保存。    1.4  主要试剂    乙腈色谱纯(天津市大茂化学试剂厂，批号20051119)；磷酸分析纯(批号20050907)和三乙胺色谱纯(批号20041105)均为成

10、都市科龙化工厂产品。    1.5  仪器    津岛LC2010A高效液相色谱系统，NC2000色谱工作站，SPD10A型紫外可见分光光度检测器。    2  方法    2.1  体外BF模型的建立2    用孔径为0.22m的医用微孔滤膜封闭直径为1cm的玻管一端。玻管无菌处理后，滤膜端向下置于24孔板中。向玻管中加入500l菌液和一定量LB培养基，24孔板的每孔内加入适量培养基，使液面与玻管内液面相平，37连

11、续培养7d后，每个玻管内加入相应药物，作用不同时间取样，以HPLC测定24孔板中每孔玻管外的环丙沙星浓度。    2.2  滤膜上BF的鉴定3    加药前随机抽取3孔，用银染法鉴定滤膜上BF形成的情况。    2.3  最低抑菌浓度(MIC)的测定    采用微量稀释法测定环丙沙星、克拉霉素对PAO1菌株的MIC。    2.4  用HPLC法测定LB培养基中环丙沙星的浓度4    (

12、1)色谱条件  色谱柱：Alltech Alltime C18(150mm×4.6mm，5m)，柱温35；流动相：稀磷酸乙腈为8713(三乙胺调节pH至3.0±0.1)；检测波长278m，流动相流速0.8ml/min。理论板数按盐酸环丙沙星峰计算不低于2000，盐酸环丙沙星峰与相邻杂质峰的分离度符合规定。    (3)样品预处理  精密吸取样品500l于EP管中，加入乙腈1000l，涡旋30s，离心5min(10000r/min)，取上清液20l进样分析。    (4)精密度试验  按

13、照标准品溶液配制方法配制低、中、高三种浓度(0.007、0.015、0.030mg/ml)的环丙沙星LB溶液，按样品预处理方法进行预处理，分别于1d内和1周内加样检测6次，以求得日内和日间标准偏差。-     The paper shows that flavanones are abundant in longan nucleuses. It is significant to make full use of longan necleuses. It has a brilliant prospect in developing this natural res

14、ources. 【参考文献】  1Cai Changhe, Tang Xiaolang,Zhang Aiyu, etc. longan fruit pulp nutritional therapy value and its development application prospectJ. Food Science, 2002, 23 (8): 328.2Xu Jiankai. Longan high production technology question and answerM. Guangzhou: Guangdong Science and Technolo

15、gy Publishing Press,2001:56.3Tan Shuhui, Zhan Reting. Chinese medicine open country recognition handbook (2)M. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Publishing Press,2004:208.4Nanjing college of pharmacy << Chinese medicine study >> compilation group Chinese medicine study (center book) M. Nanjing:Jiangsu People's Publishing Press,1976:628.5Xiao Gengsheng, Huang Ruqiang,Ceng Qingxiao,etc. Nutrition composition of Longan seedsJ.Food Science and Technology,2004,(1):93.6Xia Xingzhou, Zhang Hui, Wei Chuanwan. In the banyan tree leaf the flavonoid withdraws the condition re