浅谈高效液相色谱—串联质谱法测定阿托伐他汀的血药浓度

1、浅谈高效液相色谱串联质谱法测定阿托伐他汀的血药浓度         【摘要】目的 建立高效液相色谱串联质谱法测定阿托伐他汀血药浓度的方法。方法 采用纯乙腈超声提取，高速离心沉淀蛋白后，以乙腈-乙酸铵缓冲液作为流动相，Phenomenex Luna 3 C18(2) 100 A (150×2.00mm 3m)反相色谱柱，在正离子模式下以电喷雾电离串联质谱进行测定。结果 血浆中阿托伐他汀的线性范围为0.1-20

2、 ng/mL，定量限为 0.1 ng/mL。方法回收率为 96%103%，日间 、日内RSD 均小于6%。 结论 本方法简单、灵敏、准确，适用于阿托伐他汀人体血药浓度的检测。  【关键词】阿托伐他汀  血药浓度  高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）  阿托伐他汀钙片是他汀类血脂调节药，为3-羟基-3-甲基一戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂1，它能够降低血浆胆固醇和脂蛋白水平，减少低密度脂蛋白的生成，临床上用于家族性高胆固醇血症、混合性高脂

3、血症等症。因其降脂作用强，副作用小，在高脂血症，特别是高胆固醇血症的治疗中得到广泛应用。本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定血浆样品中的阿托伐他汀，本法专灵敏度高、重现性好，样品处理方法简便。化学结构见图1。  图1 阿托伐他汀的结构式 Fig.1 Structure of Atorvastatin 1  实验部分 1.1材料和试剂 阿托伐他汀标准品购自中国药品生物制品检定所；前处理所用乙腈为分析纯，流动相的乙腈为色谱纯（德国 MERCK）；实验用水为超纯水，由 Milli-Q系统制作（美国Mi

4、llipore公司）。 1.2液相色谱条件 液相色谱仪器为岛津Prominence UFLC；色谱柱选用Phenomenex Luna 3 C18(2) 100 A (150×2.00mm  3m)；柱温40；流动相：乙腈乙酸铵缓冲液（乙酸铵5mmolL、甲酸0.5（v/v）（体积比6：4），等度洗脱；进样量10L；流速保持在0.3mL/min。 1.3质谱条件 质谱仪器为美国AB公司的API4000 Q-trap；电离方式：ESI（+）；选择多重反应监（MRM）；电离电压5500V，

5、辅助加热温度500，气帘气30psi，雾化气3psi，碰撞气：中等，离子源气体1：50psi，离子源气体2：60psi。阿托他汀在ESI（+）M+H+ 的MRM模式下的质谱参数见表1。 1.4血浆样品处理 精确量取血浆样品0.5mL于10mL离心管中，准确加入2.5mL乙腈，涡旋2min后，超声10min，在 4500r/min转速下离心5min。移取上清液用氮气吹干，用1mL的50%乙腈水定容 ，过0.22m滤膜 ，供LC-MS-MS分析。 表1 阿托伐他汀在ESI（+）M+H+ 的MRM模式下的质谱参数 Table 1&

6、#160; Test parameters for Atorvastatin in MRM  定量离子对(quantitative ion pair) 2 结果与讨论 2.1方法的线性范围、 相关性及检出限实验 以在血浆空白样品基体中六点添加标准品法制作校正曲线, 7点添加水平分别是0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。按本文方法进行加标回收试验，结果表明，方法此范围内线性相关，相关系数r=

7、0.9998，当信噪比S/N10时，定量下限LOQ为0.1 ng/mL。 2.2方法的精密度和回收率 取空白血浆，分别精确加入适量的阿托伐他汀标准溶液，配制成浓度为0.2 ng/mL、2 ng/mL.10 ng/mL的血浆样品各6份，按1.4步骤处理在同日内重复测定5次，并连续5天测定，计算日内、日间的精密度。得到的日内精密度（RSD%）分别为2.62、3.11、1.97，日间精密度分别为3.55、5.65、4.98。阿托伐他汀0.2 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL三个水平浓度的测定回收率结果见表2。 

8、;             表2  空白血浆阿托伐他汀的添加回收率和精密度(n=6) Table 2  Recoveries and precisions of Atorvastatin at different fortified levels (n=6) 2.3稳定性试验 取空白血浆精确加入适量的阿托伐他汀标准溶液，分别配制成浓度为0.5ng/

9、mL和2 ng/mL血浆溶液，按“1.4”项下血浆处理方法操作，分别于0、2、4、8、10h时进行色谱分析，记录峰面积。结果，RSD分别为3.56和4.14。表明样品血浆溶液在10h内稳定。 图2阿托伐他汀在MRM条件下二种离子的谱图 Fig.2 Two ion chromatograms of Atorvastatin in MRM 2.4实验条件的优化讨论 试验中比较了甲醇乙酸铵缓冲液、乙腈乙酸铵缓冲液、甲醇水和乙腈水3-6四种流动相体系，结果表明，以乙腈乙酸铵缓冲液作为流动相得到的峰型最好，出峰时间也较稳定。

10、这可能由于水相中甲酸提高了待测物在ESI正离子电喷雾中的离子化效率，乙酸铵则使检测物出峰时间较为稳定。因此本文选择用乙腈乙酸铵缓冲液作为流动相，得到的谱图峰形的对称、出峰时间和灵敏度均较理想（见图2）。   参 考 文 献 1赵冰.阿托伐他汀的临床研究进展J. 中国药房，2010,21(24):203-204. Plosker GL，Wagstaf AJFluvastatin：a review of its pharmaeology and use

11、0;in the management og hypereholesterolaemiaJDrugs, 1996, 51:433. 姜楠，杨永革，许雪廷，等. LC-MS-MS法测定人血浆中阿托伐他汀浓度J. 药学实践杂志 2 0 1 1, 2 9(1):15-17. 胡晓玲，李环德UPLC-MSMS法测定健康人血浆中的阿托伐他汀浓度及药物代谢动力学研究J. 中南药学，2008，6 (4)：400. Tatar S, Atma ca SDetermination of amlodipine in human plasma by