九.大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

1、九大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、实验目的1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。2、学习利用感受态细胞来达到转化的目的。二、 实验原理在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。1. 概念转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域

2、的基本实验技术。 2、受体细胞：一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源DNA分子的受体细胞。3、转化方法RbCl(KCl)法， CaCl2法，电击感受态制备等，RbCl(KCl)法制备的

3、感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用。电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70以下保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.4、感受态细胞制备CaCl2法：细胞处于 0 4 ， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素

4、耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 5、提高转化效率的几个因素：细胞生长状态和密度； 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 质粒的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的

5、浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或R.)，并用超纯水配制，最好分装，灭菌保存于干燥的冷暗处 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率；或者杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 三、实验

6、器材1）材料E. coli DH5菌株；Amp； 质粒DNA； 需要检测的连接产物2）设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪， eppendorf管等。 3）试剂0.1mol/L的CaCl2， LB液体培养基，LB固体培养基，Amp母液：氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液, -20保存备用。四、操作步骤 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与质粒共保温培育，实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来

7、筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 1、受体菌的培养 1） 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37180rpm振荡培养过夜； 2） 将该菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养12小时至OD600在0.5左右 ; 3） 无菌条件下取1ml菌液到预冷的1.5ml离心管中，4, 5000rpm离心4min； 4）重复步骤 3）3次，收集足够的菌； 5） 彻

8、底弃上清液，在冰浴上加入1/10V（400ul）预冷的无菌CaCl2 (0.lmol/L)，轻轻吹打，使细胞悬浮，冰浴10 min；6) 4，5000 rpm离心5min，弃上清液;7) 用200l预冷的无菌CaC12 (0.lmol/L) 重新悬浮细胞，100ul分装，冰上备用；注：如果需要保存，用160ul 预冷的无菌CaC12 (O.lmol/L)和40ul无菌的70%甘油悬浮细胞，液氮冷激10min后，-70以下保存备用。2. 转化1）取100l感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入10l连接产物（或质粒DNA）(含量不超过50ng，体积不超过10l)，轻轻摇匀，冰上30min；2）4

9、2水浴中热击90秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却2min；3）向管中加入400ul LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37，70100rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )；4）离心：将上述菌液 3000rpm 离心 2min后，弃上清300ul，剩下的菌液混匀；5）涂平板：将上述混匀后的菌液取80-100ul涂布于含Amp的筛选平板上，37倒置培养皿培养1216h。 注意：1、含Amp的LB固体培养基的配制:将灭菌的LB固体培养基水浴溶解后冷却至60左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml，摇匀后倒平板；五、实验结果1恒温培养后，实验结果如下；l 在涂布质粒DNA的平板上，可看到有大量的菌落生长，且分布比较均匀；l 在涂布连接质粒的平板上，可看到有2个菌落。2。对上述结果进行分析如下：A在含有青霉素的培养基上，质粒转化比较成功，转化子比较多。说明其质粒中含有抗性基因，受体生长良好，所以平板上可以看到大量的菌落；B。而连接质粒不可能做到100的连接效率，且由于连接过程中要在