温和化学渗透法破碎酵母细胞的研究

1、    温和化学渗透法破碎酵母细胞的研究        摘要对温和化学渗透法破碎酵母细胞以释放乙醇脱氢酶(ADH)的可能性进行了研究；研究了温和化学渗透剂（甘氨酸、丙氨酸）进行细胞破碎时，其破碎时间、化学渗透剂浓度、溶液pH值、添加表面活性剂（TritonX-100）的浓度对细胞破碎率及目的蛋白质的影响；建立了细胞破碎的动力学方程。关键词温和化学渗透剂；酵母细胞；乙醇脱氢酶 Disrupting the Yeast Cell by Mild Chemical Permeabi

2、lizationLi XialanCai EnuoZeng Mingrong（Overseas Chinese University,Quanzhou 362011）AbstractA study is made on the possibility of mild chemical pereabilization agents,such as glucine and alanine ,disrupting the cell to release alcohol dehydrogenase. Disruption time, mild chemical permeabilization age

3、nts concentration , pH of the solution ,surfactant concentration were studied ,which affects the disruption cell efficiency and protein recovery .The protein release kinetics of a permeabilization process using glycine and alanine were characterized. Key Words Chemical permeabilization， Cell disrupt

4、ion， Glycine ， Alanine80年代初，重组DNA技术得到了广泛应用，生物技术发生了质的飞跃，实验室规模的生物产品愈来愈多，但目前生物技术的下游加工过程却很薄弱，很大程度上制约了生物产品的工业化。很多生物产品属胞内物质，分离提纯这类产物时，必须将细胞壁破碎使产物得以释放。因此，细胞破碎是提纯胞内产物的关键性步骤。目前，细胞破碎的方法很多1，有机械法（如珠磨法、高压匀浆法、超声波法）和非机械法（如溶酶法、渗透压冲击、干燥法、化学渗透法）。本课题研究的化学渗透法是有选择性地加入某些化学试剂，改变细胞壁或膜的通透性，从而使胞内的物质有选择性地渗透出来的一种方法。化学渗透法过去主要用来

5、检测胞内酶的活性。用于释放胞内物质的研究近年引起人们的关注，但国内外有关这方面的研究进展缓慢，国内外的报道集中在有机溶剂、抗生素、表面活性剂、螯合剂、变性剂等化学试剂进行细胞破碎2-4。这些化学试剂在改变细胞壁或细胞膜的通透性的同时，胞内的目的生化物质易变性。本课题研究的工作之一就是寻找温和化学渗透剂，使之既能使细胞破碎，又能维持胞内目的生化物质的高活性。本文首次提出温和化学渗透剂的概念，初步研究温和化学渗透剂破碎细胞的可能性。由于我国生产的破碎细胞的设备效率较低，目前我国绝大多数胞内酶均依靠进口，因此研究适合我国国情的细胞破碎方法是必要的。乙醇脱氢酶在临床分析，科学研究及生产某些光学活性物质

6、(如R-2-OH-苯丁酸及盐类)都有广泛的应用。理论上可以作为治疗急性醇类中毒的药物。本文以干酿造酵母为研究对象，破碎干酿造酵母以释放目的蛋白乙醇脱氢酶。1实验材料1.1实验材料干酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisae），辅酶 （上海浦江应用生物化学研究所），牛血清蛋白（上海长阳生化制药厂），考马斯亮兰G-250 （Fluka进口分装），甘氨酸（上海南翔试剂厂），丙氨酸（上海试剂三厂）。1.2实验设备离心机800型（上海器械厂），分光光度计721（上海第三分析仪器厂），光栅分光光度计722（上海第三分析仪器厂），酸度计pHT-P型（中国上海大中分析仪器厂）。1.3实验方法

7、552实验结果2.1甘氨酸及丙氨酸破碎细胞21.1甘氨酸及丙氨酸破碎细胞的破碎时间对蛋白质浓度及ADH活性的影响将干酵母细胞浸泡后，加入pH8.0、2.00mol/L的甘氨酸或pH8.0、1.00mol/L的丙氨酸，不加TritonX-100，破碎时间对蛋白质浓度及ADH活性的影响见1。ADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala systemFig 1Effect of disruption time on ADH activity

8、and protein releaseADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala systemFig 2Effect of chemical permeabilization agentsconcentration on ADH activity and protein release213pH值对蛋白质浓度及ADH活性的影响将干酵母细胞浸泡后，加入不同pH值的2ml/L甘氨酸(破碎时间4h)或1ml/L的丙氨酸溶液(破碎时间6h)，

9、不加Triton X-100,pH对蛋白质浓度及ADH活性的影响见3。ADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala systemFig 3Effect of pH on ADH activity and protein releaseADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala

10、systemFig 4Effect of TritonX-10 concentration on ADH activity and protein release从4可知，不论是甘氨酸还是丙氨酸，随着TritonX-100浓度的增大，蛋白质浓度和ADH活都先增大后减小，TritonX-100浓度达某一浓度时（甘氨酸：5.00%，丙氨酸：7.00%），蛋白质浓度与ADH活性都有一最大值（甘氨酸中986.35U/ml,丙氨酸中1198.98U/ml）。当TritonX-100浓度大于某一浓度时（甘氨酸中5.00%，丙氨酸中7.00%），在液相中出现混浊，经离心后得到白色沉淀。2.2传统化学渗透剂(

11、盐酸胍、TritonX-100)与温和化学渗透剂(甘氨酸、丙氨酸)对细胞破碎效率的比较将干酵母细胞浸泡后，单独加入pH8.00, 2.00mol/L的盐酸胍溶液,2.00ml/L的TritonX-100溶液、2.00ml/L的甘氨酸溶液、1.00mol/L的丙氨酸溶液破碎细胞，细胞破碎情况的比较见5。中横坐标为实验条件下可达到的最大蛋白质浓度及ADH活性。中纵坐标为达到指标最大值的细胞破碎时间。5蛋白质浓度的最大值以盐酸胍破碎最高，甘氨酸次之，TritonX-100最低。5ADH活性的最大值以丙氨酸最高，甘氨酸次之，盐酸胍最低。中清楚显示，盐酸胍破碎细胞的效率最高，但同时造成ADH变性失活，而

12、甘氨酸和丙氨酸在破碎细胞的同时，能维持ADH的高活性，其中又以丙氨酸效果更好。ADH activity,protein conc,A:guanidine-HCl system,B:Gly system,C:Ala system,D:triton X-100 systemFig 5The comparison of several chemical permeabilization agents disrupting the cell2.3细胞破碎的动力学方程的建立化学渗透法破碎细胞的主要过程包括：A.化学渗透剂从主体浓度扩散到细胞表层；B.化学渗透剂从细胞表层扩散到细胞内；C.化学渗透剂与细胞

13、壁和细胞膜反应以及胞内蛋白的释放；D.胞内蛋白向胞外扩散；E.化学渗透剂从细胞壁外扩散到主体浓度。由于化学渗透剂分子量小，扩散阻力不大；细胞内压较高，蛋白质向外扩散较快。由于搅拌化学渗透剂在液相中的扩散速度很快，故可认为A、B、D、E四步为非控制步骤。化学破碎过程可简化为一级动力学模型，B为控制步骤。其中，P为释放总蛋白，Pm为释放总蛋白最大值，k为蛋白释放速度常数，t为破碎时间。当t=0时，P=Po；则上式积分得：P=(Po-Pm)exp(-kt)+Pm对实验数据进行非线性回归得到的回归方程式如表1和6。Explain:(1) left fig is Gly system,right fig

14、 is Ala system(2) spot is experiment spot, curve is protein-release regression curveFig 6The protein release from the cell treated with chemical permeabilization agents against disruption timeTab 1The protein release kinetics equation of disruption process using chemical permeabilization agentsPerme

15、abilizationagentsRegression equationCorrelationStandarderrorGlyP=19.96+(14.93-19.96)exp(-0.2169x)0.99750.1144AlaP=19.25+(14.78-19.25)exp(-0.1479x)0.99540.1207从表1和6可知:温和化学渗透剂（甘氨酸、丙氨酸）破碎细胞时蛋白质释放的动力学理论模型与实验数据吻合较好。 3讨论1) 化学渗透剂的极性问题酵母细胞壁的主要成分为葡聚糖与甘露糖以及蛋白质等。酵母细胞壁最里层是由葡聚糖的细纤维部分组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状。覆盖

16、在细纤维上的是一层糖蛋白，再外层是由1,6-磷酸二酯键共价连接而成网状结构的甘露聚糖，在甘露聚糖的内部有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。当用甘氨酸、丙氨酸等分子量较小的非极性R基氨基酸进行了破碎酵母细胞时,甘氨酸的侧链中含有不解离的弱极性基-H，能与-N、-P、-O形成氢键，丙氨酸的侧链中含有疏水基-CH3，不论是甘氨酸还是丙氨酸其分子中的NH+3、-COO极性都很强。甘氨酸、丙氨酸破碎细胞的机理可能是因为小分子的甘氨酸、丙氨酸更易渗透到酵母细胞壁外侧的甘露聚糖孔隙间，通过氢键、范德华引力、静电引力等

17、化学亲和力改变甘露聚糖网状结构，从而改变细胞壁和细胞膜的通透性，使得胞内蛋白得以释放。2)破碎时间对蛋白质浓度及ADH活性的影响一般说来，甘氨酸及丙氨酸破碎细胞的时间越长，被破碎细胞的数量必然越多，即液相中的蛋白质的浓度越高。甘氨酸与丙氨酸相比，在相同的破碎时间里，液相的蛋白质浓度相差不大，但甘氨酸破碎细胞时，ADH的活性却高于丙氨酸破碎细胞的ADH活性。究其原因，我们认为甘氨酸的PI=5.97，丙氨酸PI=6.02，两者的PI值都相近，pH值相同时，其带电情况几乎一致，因此它们的带电状况对细胞的破碎影响趋势相同；若考虑到甘氨酸及丙氨酸除侧链基团不相同外，其余基团相同，因此甘氨酸及丙氨酸破碎细

18、胞时ADH的活性相差很大或许与甘氨酸、丙氨酸侧链基团极性大小有关，其侧链基团极性大小不同，对ADH的高级结构影响是不一样的。有关原因需要进一步探讨。3) 甘氨酸及丙氨酸浓度对蛋白质浓度及ADH活性的影响一般说来化学渗透剂浓度越大，酵母细胞周围有更多的化学渗透剂分子，渗透到细胞壁间的分子数量更多，增加了甘露聚糖网状结构的破坏程度，使得更多的胞内蛋白渗出。但化学渗透剂的浓度过大，会破坏了ADH的高级结构，使得蛋白质及ADH活性都下降。4) pH值对蛋白质浓度及ADH活性的影响实验结果表明pH值的变化，对细胞破碎率影响较小。我们认为在pH>6.0时，甘氨酸和丙氨酸都呈带负电的离子状态，因此在本

19、实验的pH条件下，甘氨酸及丙氨酸对细胞破碎的影响趋势是相同的。在此实验条件下，pH值主要影响了ADH的高级结构,ADH在 pH 8.8时最稳定5,pH偏酸或偏碱,都使ADH的高级结构遭到破坏,造成ADH活性下降。5) 加入TritonX-100对破碎细胞及ADH活性的影响TritonX-100是一种非离子表面活性剂，它具有亲水性部分和憎水性部分，溶于水后，低浓度时，其分子分散在水中，似真溶液一般，浓度增至某一值，其分子间的距离不断缩短，遂借烃键之间的引力，分子便会相互吸引而形成聚集体，此聚集体被称为“微团”。在“微团中”TritonX-100分子的憎水基朝内，亲水基朝外，微团把疏水性物质“溶解

20、”在自己的憎水部分中，TritonX-100“微团”能溶解细胞壁上的蛋白质，因而具有破碎细胞壁的能力6。因此，在甘氨酸或丙氨酸中添加TritonX-100则大大增加细胞破碎率。但TritonX-100浓度大于某一浓度时，其造成了蛋白质的变性失活，使得蛋白质浓度和ADH活性都下降,从可知此时ADH活性受TritonX-100影响很大。此外，实验过程发现TritonX-100单独使用时，液相中蛋白质含量及ADH活性均不高，但与甘氨酸及丙氨酸相结合使用时，无论是蛋白质浓度还是ADH活性均较高。这可能是TritonX-100“微团”既能溶解疏水性物质，又能保护ADH的高级结构（与“反胶束”萃取原理相同）。4结论与传统化学渗透剂相比，甘氨酸和丙氨酸在破碎细胞的同时，又能维持ADH的高活,这对释放胞内产物,尤其对胞内具有生物活性的生