扁穗牛鞭草种质遗传多样性的ISSR分析

1、扁穗牛鞭草种质遗传多样性的ISSR分析范彦1,2，李芳1，张新全1* ，马啸1（1. 重庆市畜牧科学研究院 重庆 400039；2 四川农业大学草业科学系，四川 雅安 625014.）摘要：用ISSR标记对来自中国西南地区(四川、重庆、贵州)的28份扁穗牛鞭草材料的遗传多样性进行了检测。从96个ISSR引物中共筛选出13个多态性明显、反应稳定的引物，对28份材料DNA共扩增出129条谱带，平均每个引物扩增出9.9条带，多态性条带比率达84.2%。材料间遗传相似系数在0.4660.98之间，表现出丰富的遗传多样性。通过聚类分析和主成分分析，将28份扁穗牛鞭草分为两大类，同一地区的扁穗牛鞭草品种(

2、系)基本聚在同一类，呈现出一定的地域性分布规律。基金项目：重庆市自然科学基金（CSTC,2006BA1022）；教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-04-0909)。作者简介：范彦（1973-），男，四川乐山人，四川农业大学在读博士，研究方向：牧草与草坪草种质资源及育种。E-mail:cq_fy001；Tel：02346792513关键词：扁穗牛鞭草；种质；ISSR；遗传多样性分析Genetic Diversity of Hemarthria compressa Germplasm Detected by Inter-simple Sequence Repeat (ISSR)FAN Y

3、an1,2, LI Fang1，ZHANG Xin-Quan1*, MA Xiao1（1. Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Sichuan Yaan 625014，China）（2. Chongqing Municipal Institute of Animal Husbandry Chongqing 400039, China）Abstract: Inter-simple sequence repeat (ISSR) method was applied to detect genetic v

4、ariation of 28 Hemarthria compressa accessions from Southwest China (Sichuan Province, Chongqing City and Guizhou Province). Thirteen primers were selected from 96 ISSR primers, and 129 DNA fragments were amplified from 28 samples. Of which, 110 fragments were polymorphic (percentage of polymorphic

5、bands was 84.2%), and the average number of DNA bands was 9.9 per primer. The genetic similarity among all accessions ranged from 0.466 to 0.98, which indicated that the genetic diversity was comparatively rich among the tested accessions. UPGMA cluster based on genetic similarity and principle comp

6、onent analyses (PCoA) based on band patterns divided the accessions into two groups corresponding to their geographical sources. Key words: Hemarthria compressa; Germplasm；ISSR; Genetic diversity analysis牛鞭草属(Hemarthria R.Br.)植物主要分布在热带、亚热带及北半球的温带湿润地区，我国有4个种和1个变种，即:扁穗牛鞭草H.compressa(L.F.)R.Br.、牛鞭草H. A

7、ltissima (Poir) Stapfet C. E. Hubb.、长花牛鞭草H. Longiflora (Hook.f.) A.Canus、小牛鞭草(H.protensa Steud.)及变种族穗牛鞭草H.compress var.fasciculate(Lam.)Keng，其中分布最广的是扁穗牛鞭草1。扁穗牛鞭草为多年生匍匐性禾草，主要靠地上茎繁殖，是一种生长期长、生长速度快、再生力强和产量高的常年青绿优良饲草2。在长江流域，野生扁穗牛鞭草分布相当广泛，且存在多种生态类型。因其绿期长、固土力强且耐粗放管理，具有较强的适应性和抗逆性，也可作为水土保持植物和草坪草开发利用，对长江流域退耕还

8、草、种草养畜、水土保持及环境绿化等均具有重要意义，是热带、亚热带建植人工草地、南方草山草坡改良的优良草种3。目前国内外有关牛鞭草属植物的研究主要集中在细胞学、抗逆性和适应性、侵占性、独居和化感作用等方面，而在种质遗传多样性方面的研究报道较少48。1994年由Zietkiewicz9等创建的ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子标记技术克服了RAPD标记稳定性差、RFLP技术费用高、AFLP技术操作繁琐和SSR技术预先根据其靶序列设计引物等缺点，其重复性和稳定性好10，已被广泛用于品种鉴定11、种质遗传多样性分析1214、指纹图谱构建15等研究中。本试验运用IS

9、SR标记对我国西南区28份扁穗牛鞭草资源的遗传多样性进行了研究，旨在明确ISSR标记在扁穗牛鞭草品种鉴定和种质遗传多样性研究中的作用，为我国扁穗牛鞭草种质的合理利用及新品种选育提供理论依据。1 材料与方法1.1 供试材料 材料为西南区收集的的28份优良扁穗牛鞭草无性系 (表1)。其中，“重高”和“广益”是四川农业大学杜逸等1987年利用无性系重复选育，从野生扁穗牛鞭草中选育的直立型扁穗牛鞭草品种16。表1 扁穗牛鞭草材料编号及来源Table 1 Sampled locations and habitant of Hemarthria compressa编号NO.名称name采集地点Collec

10、tion Location海拔Altitude(m)编号NO.名称name采集地点Collection Location海拔Altitude(m)1YA2002-2四川洪雅阳坪Hong Ya County Sichuan province41615H029四川宁南Nin Nan County Sichuan province6502YA2002-4四川洪雅阳坪Hong Ya County Sichuan province41616H031重庆李子坝Li Zi Ba Chong Qing Province2603YA2002-5四川洪雅阳坪Hong Ya County Sichuan provi

11、nce41617H033重庆万州WanZhou County Chong Qing Province4904YA2003-1四川洪雅阳坪Hong Ya County Sichuan province41618H035重庆梁平Liang Pin County Chong Qing Province4005YA2003-2四川洪雅阳坪Hong Ya County Sichuan province41619H040重庆垫江DianJiang County Chong Qing Province4106YA2003-3四川洪雅阳坪Hong Ya County Sichuan province41620

12、H042贵州独山Du Shan County Gui Zhou Province9307YA2003-4四川雅安Ya An County Sichuan province41621H043贵州独山Du Shan County Gui Zhou Province9508YA2003-5四川雅安Ya An County Sichuan province41622H047贵州荔波Li Bo County Gui Zhou Province3709YA2003-6四川雅安Ya An County Sichuan province41623H053四川宁南Nin Nan County Sichuan p

13、rovince110010H001四川大渡河Da Du River Sichuan province50024H054四川自贡Zi Gong County Sichuan province64011H002四川雅安Ya An County Sichuan province41625H055四川自贡Zi Gong County Sichuan province62012H016四川眉山Mei Shan County Sichuan province46526H065四川雅安Ya An County Sichuan province41613H019四川草坝Cao Ba County Sichua

14、n province48027广益Guang Yi四川雅安Ya An County Sichuan province41614H026四川宁南Nin Nan County Sichuan province120028重高Chong Gao重庆Chong Qing Province600注：编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9的材料为“广益” 扁穗牛鞭草品种的选系Note: Codes 1-6 and codes 7-9 are the excellent clone strains from cultivar Guangyi.1.2 DNA提取 取生长良好的扁穗牛鞭草幼嫩植株的叶片，参照S

15、aghai-Maroof M A等(1998)的CTAB17方法提取DNA。1.3 ISSR反应体系的建立及优化本试验参考了地毯草（Axonopus compressus (Sw.) Beauv）18、鸭茅（Dactylis glomerata）19的ISSR扩增程序和反应体系，PCR反应程序为：94预变性5min；94变性45s，52退火60s，72延伸90s,45个循环；72延伸7min，4保存。并对反应体系各组份进行了梯度PCR试验，所得20L优化反应体系为：Mg2+ 1.625mM、dNTP 250M、Taq酶1.0U、引物浓度 0.75m、模板DNA量 4ng/L。1.4 ISSR引

16、物的筛选采用加拿大British Columbia大学公布的96个常用ISSR引物序列，由大连宝生物公司合成。每个引物取少量稀释成10pmol/L，用YA2003-3、H001、H043、H055 4份材料的DNA作为模板，在96个引物中筛选出多态性高的引物，再对全部材料进行PCR扩增。1.5 PCR扩增及电泳PCR扩增在Thermo Hybaid PCR仪上进行。PCR反应结束后向扩增产物中加入6L的6×loading buffer，用1.6%的琼脂糖凝胶电泳（5V/cm），凝胶中含0.01%溴化乙锭，电泳5h后用BIO-RAD凝胶成像系统对凝胶板检测并照相并分析。1.6 数据统计

17、对获得的DNA条带进行统计，在相同迁移位置，有带记为1，无带记为0，依此构成原始数据矩阵，利用NTSY-PC2.10软件计算Dice遗传相似系数，根据UPGMA法 (Unweighted pair group method arithmetic averages) 20进行聚类分析和主成分分析（PCoA）。2 结果与分析2.1 筛选引物从96条引物中共筛选出13条多态性好、条带清晰的引物(表2)，用于供试28个材料的PCR扩增。在13个引物中，有8个二核苷酸重复序列，1个四核苷酸重复序列，2个五核苷酸重复序列，1个5锚定的重复序列，1个混合基元。表2 用于扁穗牛鞭草ISSR分析的引物序列Tab

18、le 2 Primer sequences used in ISSR analyses of Hemarthria compressa引物代号引物序列(5-3)引物代号引物序列(5-3)Primer codePrimer sequencePrimer codePrimer sequence811(GA)8C860(TG)8RA817(CA)8A873(GACA)4821(GT)8T880(GGAGA)3853(TC)8RT881(GGGGT)3855(AC)8YT886VDV(TC)856(AC)8YA895AGA GTT GGT ACG TCT TGA TC857(AC)8YG：D = (A

19、,G,T)，V = (A,C,G)，R = (A,G)，Y = (C,T)2.2 ISSR扩增结果及多态性分析13个引物共扩增出129条带，片段大小在300bp2000bp之间;平均每个引物的扩增条带数为9.9条，最多能得到14条清晰带(857、895),最少有7条(860、881、886);多态性条带总数为110条，平均每个引物能扩增出8.5条，引物的平均多态性比率为84.2%(表3)。其中，多态性最高的为混合基元895号和二核苷酸重复序列857号，可分别扩增出14条和13条多态带，多态性比率分别达100%和92.9%。这表明，如果对扁穗牛鞭草进一步做ISSR研究，其引物最好选混合基元和二核

20、苷酸重复序列类型的引物。2.3ISSR鉴定标记在所用的ISSR引物中，以引物857区分28个材料的效果较为明显，即使是亲缘关系很近的材料，也可根据其指纹将其分开(图1)。“广益”的9个选系与“广益”相比都存在一定的ISSR变异；其次，在“广益”的9个选系中，来自四川雅安的3个材料和来自四川洪雅阳坪的6个材料间在约1100bp、600bp、440bp处有分别有一条多态性带，在来自四川洪雅阳坪的6个材料中，YA2003-2在700bp处有一条特有带(箭头所示)，与其它5个材料间均存在一定差异，这说明ISSR标记在扁穗牛鞭草指纹图谱建立和品种鉴定中具有较好的效果。表3 扁穗牛鞭草ISSR标记的多态性

21、分析Table 3 Polymorphism analysis for banding patterns amplified of H. compressa by different ISSR primers引物primer扩增总条带Total numbers of polymorphism bands多态性条带数Numbers of polymorphism bands多态性比率The percent of polymorphism bands811121083.3%81711981.8%8219777.8%85310880%8558787.5%8569888.9%857141392.9%8

22、607571.4%8739777.8%880121083.3%8817685.7%8867685.7%8951414100%合计(Sum)129110平均 (Mean)9.98.584.2%2000bp1000bp750bp500bp250bp图1 857号引物对28份材料DNA的ISSR扩增图谱Fig.1 ISSR fingerprint amplified with primer No.857 in 28 DNA of Hemarthria compressa2.528份扁穗牛鞭草材料聚类分析利用NTSYS软件计算出的28份扁穗牛鞭草材料间遗传相似系数(GS)值变动于0.4660.98之间

23、，平均GS值为0.722。其中来自四川宁南的H029和贵州独山的H042之间的遗传相似系数最小，为0.466，表明它们之间的亲缘关系最远；来自四川阳坪的YA2002-4和YA2002-5之间的遗传相似系数最大，为0.98，说明其亲缘关系最近。第类第类图2 28个扁穗牛鞭草材料的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram for 28 Hemarthria compress accessions based on DICE coefficient进一步采用UPGMA法对供试28份材料进行聚类分析，其结果如图2所示。在GS=0.61处，可把28份扁穗牛鞭草分为2个类群，其中来自贵

24、州的3个材料H042、H043、H047聚为一类(第类)；剩下的所有材料聚为一类(第类)，均来自重庆和四川的材料，这与重庆和四川地理位置很接近，生境比较相似有一定关系。另外，结合陈永霞等对供试牛鞭草材料的形态聚类分析21，又可将28份材料分为4组。第类均为较纤细低矮型(A组)；在第类中，H019、H031、“重高”为粗壮低矮型(B组)，H001、H016、H026、H029、H033、H040、H035、H053、H054、H05为最纤细最低矮的类型(C组)，YA2002-2、YA2002-4、YA2002-5、YA2003-1、YA2003-2、YA2003-3、YA2003-4、YA200

25、3-5、YA2003-6、H002、H065、“广益”为高大粗壮型(D组)，且“广益”扁穗牛鞭草的无性选系全部聚在一起。从聚类结果可以看出，相同或相近地理来源的材料基本聚在一起，说明遗传多样性与其地理来源有一定关系；其次，同一形态类型的扁穗牛鞭草材料也基本聚在一起，其遗传多样性与其形态多样性相吻合。2.6扁穗牛鞭草主成分分析 对28份扁穗牛鞭草种质的ISSR标记的原始矩阵进行主成分分析，前3个主成分所能解释的遗传变异分别为18.52%、11.49%和9.64%。对28份种质做前3个主成分的三维排序图（图3），位置靠近者表示关系密切，远离者表示关系疏远，将位置靠近的扁穗牛鞭草材料划归在一起，可将

26、供试材料分成4个组，与聚类分析结果基本一致。图3 依据ISSR标记对扁穗牛鞭草种质进行主成分分析的三维散点图Fig.3 The 3 dimensions plot of the principal components analysis on H. compressa accessions with ISSR markers3.讨论与结论 对来源于四川、重庆、贵州地区的28份扁穗牛鞭草材料进行ISSR分子标记遗传多样性分析的结果表明，平均每个引物扩增的多态条带数为8.5条，多态性条带比率为84.2%；材料间遗传相似系数范围在0.466到0.98间，平均GS值为0.722，从而在DNA分子水平上

27、说明了不同扁穗牛鞭草种质材料(无性系)之间的遗传差异较大，遗传多样性较丰富。聚类分析和主成分分析结果显示，28份扁穗牛鞭草材料可划分为2大类4组，这与形态学的划分基本一致，但同属C组的H001在ISSR聚类图上与C组其它材料明显分属2个聚类群，这说明形态学数据由于数量有限、且易受环境影响，不足以表明扁穗牛鞭草种质的所有多样性。一般而言，对扁穗牛鞭草等以无性繁殖为主的牧草，宜采用无性系的系统选择来进行品种选育，因而建立快速的品种指纹图谱对于加快育种进程和新品种保护具有重要意义。从本研究的结果看，利用ISSR标记技术可以获得清晰且多态性高的扁穗牛鞭草电泳图谱。利用单独一个多态性好的引物基本上能将2

28、8份材料分开，且各材料特征带明显，说明ISSR标记用于扁穗牛鞭草遗传多样性研究及不同材料的DNA水平识别是可靠的，这为利用ISSR技术构建扁穗牛鞭草品种的指纹图谱，保护产权和辅助育种奠定了良好基础。另外，本研究发现来自“广益”的无性系选系间存在一定的变异，这可能是由于长期种植后，自然条件及栽培环境等的变化所产生的基因变异，这为在优良扁穗牛鞭草品种中进一步选育提供了理论依据。 参考文献：1 中国科学院植物所.中国植物志(第十卷,第二分册)M.北京:科学出版社,1997,10(2):262.2 张健,黄勇富,张家骅,等.扁穗牛鞭草生产及利用的发展现状和潜力J.草业科学,2003,20(7):161

29、9.3 顾荣申,洪汝兴.牛鞭草的栽植和利用J.草与畜杂志,1991,(1):3234.4 DeWet J M. Chromosome number of a few South African grassesJ.Cytologia, 1954, 19:971035 刘金平,张新全,陈永霞. 西南地区野生扁穗牛鞭草种质资源抗锈病能力的研究J.草业学报,2006,15(4):6570.6 Foy C D , Oakesa A J. Tolerance of limpograss (P1364344) to excess manganese in soil land and nutrient sol

30、utionJ. Journal of Plant Nutrition, 1984, 7(6):953960. 7 Tang C S，Young C C. Collection and identification of allelopathic compound from the undiscurbed root system of Biganlta limpograss (H. altissima) J. Plant Physiology,1982,69(1)：155160.8 Young C C. Bartholomew D P Allelopathy in a grass legume

31、association emtlon: I. Effects of H. altissima (Poir.) stapf. and Hubb root residues on the growth of Desmodium miortum (Mill.). urb. and H. altissima in a tropical soil J. CropScience, 1981, 2l (5):770774. 9 Zietikiewicze, Rafalske R A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (ISS

32、R) anchored and polymerase chain reaction amplification J. Genomica, 1994, 20:178183.10 王建波，ISSR分子标记及其在植物遗传学中的应用J.遗传,2002,24(5):613616.11 Fang D Q, Roose M L. Identification of closely related citreus cultivars with inter simple sequence repeat markers J. Theoretical and Applied Genetics, 1997, 95:408417.12 Femandez M E, Figueiras A M, Benlto C. The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity among barley cultivars with known origin J. Theoretical and Appli