‘云香’水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析

1、云香水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析 2.5 NtNAC1转基因烟草的分子鉴定 随机选择12株抗性植株，稀释其DNA至同一浓度，PCR扩增19号泳道出现约1000 bp特异性条带，与重组质粒长度一致，获得9株阳性株系。GUS染色显示，阳性株系呈现蓝色且维管束部分颜色较深。以上结果均说明云香NtNAC1已胜利导入烟草中，选取条带光明的2、3、9号株系继续培育，用于后续转基因植株的功能鉴定。2.6 NtNAC1转基因烟草株系抗逆性鉴定T1代阳性株系根长试验发觉，正常生长条件下对比组1/2 MS，野生型与转基因植株根长无明显差异。模拟逆境胁迫下根长均受到不同程度的抑制，野生型植株根系伸长严峻受阻

2、，其中ABA处理后，植株根长小于10 mm受抑制程度最严峻，甘露醇、NaCl胁迫下，转基因株系根长较野生型发育良好，这说明NtNAC1过表达增添了转基因烟草根系对ABA的敏感性和对干旱、高盐的耐受性。烟草植株WT和3个转基因株系TP-2、TP-3、TP-934叶期时进行抗逆性鉴定，对比组正常生长条件，过表达NtNAC1转基因植株和野生型表型无显著差异;试验组15 d胁迫处理后发觉，干旱胁迫下转基因烟草相较对比组生长发育缓慢，叶片外表积小，野生型植株叶片开始变黄，而转基因植株长势良好;盐胁迫下大部分植株叶片萎蔫发黄，甚至枯萎，野生型枯萎速度高于转基因植株，说明水仙NtNAC1过表达减轻了逆境胁迫

3、产生的损害，提高了烟草的抗性。不同小写字母表示在相同组织中不同处理时间点的差异显著性P0.05。3 商量NAC转录因子广泛存在于植物中，参加响应高盐、干旱、低温或高温等非生物胁迫，其基因功能的多效性在转基因应用中特别有益，即通过转变1个NAC基因的表达实现多种定向改进15，因此克隆和鉴定优良非生物胁迫相关NAC转录因子具有重要意义。云香水仙较其他多花水仙品种抗性强16，本讨论利用RT-PCR技术从云香水仙中克隆了1个新的NAC转录因子基因NtNAC1，其编码的蛋白与同一品种云香NtNAC3153蛋白相像性低，在C端几乎没有相同的残基，说明两者分化较久，在功能上可能有所分化。这一现象也出如今其他

4、植物中，包括拟南芥AtNAM17、大豆GmNAC1618、陆地棉GhNAC1619、鹰嘴豆CarNAC1620等。进化树分析结果，NtNAC1聚分在SNAC1亚家族。同一亚家族中，小麦TaNAC47在拟南芥中过表达时增加了植株对外源ABA的敏感度，增添了对干旱、盐和低温胁迫的耐受性21;香蕉MusaSNAC1通过提高干旱胁迫下保卫细胞中H2O2含量来诱导气孔关闭，削减水分损失，从而提高过表达株系的抗旱性22。由此，可推想NtNAC1与这些蛋白具有相像功能，即响应逆境胁迫，提高植株的抗性。本讨论中，NtNAC1的表達水平主要受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG胁迫诱导，具有时空特

5、异性。这一表达模式不仅与云香NtNAC3153相像，即均能被ABA、高盐诱导NtNAC1峰值表达量高于NtNAC3153，其基因功能可能更强大，还与SNAC1亚家族其他植物基因类似，例如，拟南芥ANAC019、ANAC072在叶和根中高表达，盐胁迫下叶和根中的表达量上调23;小麦TaNAC29、TaNAC2D在叶中高表达，根中表达量相对较低，盐、干旱、ABA等非生物胁迫下叶和根中的表达量均急剧上升24;小麦TaNAC47受ABA、4 、PEG、高盐胁迫诱导表达21。明显，抗逆基因的可诱导性有利于植物快速响应不同的逆境，增加在逆境下的生存能力。本文发觉，NtNAC1的表达具有时空特异性，比方在根中表达量高、叶中次之;在花瓣和副冠中的表达模式也不同，除可能与这些组织或器官的发育阶段不同对逆境的抵抗力不同这一解释外，我们不能排除该基因还有其他潜在的生物学功能。大量讨论说明，通过转基因技术将NAC过表达，能不同程度地提高对非生物胁迫的耐受性。如，小麦TaRNAC1在根系过量表达，可以促进根发育、增加生物量和产量，提高抗旱性25;陆地棉GhNAC79过表达提高了转基因拟南芥、棉花的抗旱性26;鹰嘴豆CarNAC6在拟南芥中过表达，促进转基因植株根系生长，提高其对干旱和高盐的耐受性27。本讨论同样发觉，接受农杆菌介导法将水仙NtNAC1转入烟草中过表达，促进了转基