RNA干扰和siRNA转染实用

1、RNA干扰和siRNA转染实用内内 容容第一部分 RNAi实验基本概念第二部分 RNAi实验具体设计第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答第一部分第一部分RNAi实验基本概念实验基本概念主要内容主要内容1.RNAi的概念2.RNAi的启动途径3.非哺乳动物系统的RNAi实验4.哺乳动物系统的RNAi实验5.RNAi效应表现1.RNAi的概念的概念RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。2.RNAi的启动途径的启动途径(1) dsRNA途径(2) siRNA途径(3) s

2、hRNA表达载体途径(1) dsRNA途径途径dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi的发生。但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素效应）。(2) siRNA途径途径小干扰RNA，长21-23bp，双链。作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。(3) shRNA表达载体途径表达载体途径s

3、hRNA表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，导致RNAi的发生。3.非哺乳动物系统的非哺乳动物系统的RNAi实验实验如线虫、果蝇等可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常200bp）介导RNAi的发生 。长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。4.哺乳动物系统的哺乳动物系统的RNAi实验实验通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的基因表达抑制时间。通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因

4、表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载体较为合适。5.RNAi效应表现效应表现RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。第二部分哺乳动物系统的RNAi实验设计主要内容主要内容1. 需要短期抑制还是长效抑制?2. 采用siRNA进行实验的途径3. 构建shRNA表达载体进行实验4. siRNA设计需要注意的问题5. 脱靶效应6. 转染是RNAi实验的瓶颈1.需要短期抑制还是长效抑制需要短期抑制还是长效抑制?1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。2周以上长

5、效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长。2. 采用采用siRNA进行实验的途径进行实验的途径(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便(2) 体外转录(3) Dicer/RNase酶解这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率3.构建构建shRNA表达载体进行实验表达载体进行实验需要构建相关质粒可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表达不能做荧光标记，无法直观知道转染效率4.siRNA设计需要注意的问题设计需要注意的问题(1) siRNA序列设计(2) 阴性对照的作用(3) 阳性对照的重要性(4) siRNA荧光标记的问题(1) siRNA的设计的设计理想的

6、siRNA序列是特异性强，抑制效率高。可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。(2) 阴性对照阴性对照siRNA的作用的作用阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。(3) 阳性对照阳性对照siRNA的重要性的重要性阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因；用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检

7、测方法是否可行等；阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因，耽误时间。(4) siRNA荧光标记的问题荧光标记的问题采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时，如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的siRNA。5.RNAi Off-target(脱靶效应脱靶效应)(1) 什么是RNAi Off-

8、target(脱靶效应)?(2) 脱靶效应如何检测？(3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？(4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？(5) 如何避免脱靶效应？(1) RNAi Off-target(脱靶效应脱靶效应)是什么？是什么？RNAi Off-target(脱靶效应)：简单地说，就是siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。目前已广泛引起研究者重视。(2) 脱靶效应如何检测？脱靶效应如何检测？多种方法可以用于预测和检测脱靶效应，最常见的方法是基因表达谱芯片的方法。(3)

9、siRNA浓度是否和脱靶效应相关？浓度是否和脱靶效应相关？以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上低浓度同样会产生脱靶效应。(4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？转染试剂是否也会造成脱靶效应？有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的细胞基因表达影响发现，某脂质体L2K可以引发1908个基因的表达变化，既包括下调，也包括上调。如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA后该基因可能会出现表达不变甚至增强的现象，从而出现假阴性现象，如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达下调，则会出现假阳性现象。(5) 如何避免脱靶效应？如何避免脱靶效应？脱靶效应并不能绝对避免，但可以采取措施减少脱靶效应

10、的发生，如针对同一靶基因设计2条以上抑制效率在70以上的不同siRNA序列，分别进行实验，可避免siRNA造成的脱靶效应；采用不同转染试剂进行实验可避免转染试剂造成的脱靶效应等。6.转染是转染是RNAi实验的瓶颈实验的瓶颈 转染是siRNA实验的瓶颈，转染质量的好坏直接关系RNAi实验的成败。(1) 选择转染方法的原则(2) siRNA转染的方法(3) siRNA转染试剂的主要种类(4) 脂质体(5) 非脂质体聚合物类(1) 选择转染方法的原则选择转染方法的原则高转染效率：较高的转染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于实验结果的观察；低细胞毒性：因为RNAi是抑制性实验，转染试剂的毒性多导致细

11、胞凋亡等结果，这种结果是对细胞正常生理功能严重干扰（主要表现为抑制），细胞无法进行正常转录表达而出现凋亡。转染试剂的毒性不仅干扰细胞正常的生理状态，甚至还可能影响实验结果；方法简单、操作简单：越简单，操作越少的实验过程，自然出错的机会就少，重复性就好，工作量也少；成本较低：由于siRNA转染需要筛选有效的siRNA，有效siRNA后续大量研究还需要不断进行siRNA转染，siRNA转染的成本尤其是转染试剂的成本在实验开始之初就需要充分考虑。(2) siRNA转染的方法转染的方法到目前为止，转染的方法主要采用化学方法，化学方法不能转染的采用电转化等物理方法。(3) siRNA转染试剂的主要种类转

12、染试剂的主要种类脂质体类非脂质体聚合物类(4) 脂质体脂质体开发较早，主要针对转染质粒DNA等大分子开发，现在也被改良用于siRNA的转染；适合siRNA与质粒的共转以及一些对毒性要求不高的siRNA转染；代表产品有invitrogen公司的lipofectamineTM 2000和RNAiMAX。(5) 非脂质体聚合物类非脂质体聚合物类为克服脂质体转染试剂的毒性，并提高转染效率而开发，现在已从高分子聚合物类发展到纳米聚合物，这两年默克（Merck）、Qiagen和Clontech均相继推出了纳米聚合物类的转染试剂。英格恩生物(Engreen Biosystem)也推出了纳米聚合物转染试剂En

13、transterTM系列，其中EntransterTM-R专用于siRNA转染。第三部分第三部分siRNA转染过程相关问题及解答转染过程相关问题及解答1.siRNA转染过程相关问题2.siRNA转染疑问解答1.siRNA转染过程相关问题转染过程相关问题(1) 转染细胞数量的问题(2) 转染时siRNA工作浓度(3) 转染时血清的问题(4) 转染时抗生素的问题(5) 转染过程(6) 转染后换液的问题(7) 转染条件优化的问题(8) RNAi效应检测方法(1) 转染细胞数量的问题转染细胞数量的问题细胞数量：以转染时，细胞的汇合度在20-40为宜，这个汇合度比通常DNA转染的汇合度要小，这是因为转染

14、后需要培养的时间通常比DNA转染的时间要长，同时较低的细胞数量也有利于提高抑制效率。需要注意的是：转染时细胞的汇合度（细胞数量）会对RNAi结果产生一定的影响。一些转染试剂，如脂质体，需要的汇合度会高一些，这是为了减轻转染试剂的毒性，一般来说，细胞数量较少更能提高抑制效率。(2) 转染时转染时siRNA工作浓度工作浓度siRNA浓度：需要根据具体的实验进行相关的优化。过低的siRNA浓度达不到相应的抑制效果，过高的siRNA浓度可能会引起一些非特异的改变。需要注意的是这里siRNA浓度指siRNA在反应时的终浓度，也就是以转染时细胞的总体积来计算的。一般siRNA的有效反应浓度在10nM-20

15、0nM。需要注意的是：siRNA的分子量，对21nt双链siRNA oligo来说，平均分子量约为13300g/mol，合成siRNA其OD值和nmol换算关系由于OD值受产物中其他成分影响，如荧光标记、纯度等，具体请询问合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。 (3) 转染时血清的问题转染时血清的问题一些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h再更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R采用有血清转染，不用在有血清和无血清之间更换，增加工作量，同时有血清转染不仅不造成细胞毒性，

16、甚至还有助于提高转染效率。(4) 转染时抗生素的问题转染时抗生素的问题一些转染试剂，如脂质体，需要在转染时采用无抗生素培养基，这是由于脂质体转染会同时将培养基的一些成份包括抗生素也带进细胞，造成细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，由于不会将抗生素带进细胞，所以可以采用有抗生素转染，避免细胞污染。(5) 转染过程转染过程转染过程：转染的过程其实很简单。一般是分别稀释转染试剂和siRNA，然后二者混合，滴加到细胞表面，然后细胞继续培养。这点根据不同转染试剂的Protocol操作即可。(6) 转染后换液的问题转染后换液的问题一些转染试剂要求在转染后4-6h换液，其目

17、的就是去除在培养基中的游离转染试剂，减轻细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，大多数情况下无需转染后4-6h换液，只需第二天正常换液即可，减少了工作量，尤其大大减轻下午转染，夜里还需要换液的工作量。(7) 转染条件优化的问题转染条件优化的问题优化转染条件不仅是为得到最高的基因抑制效率，更重要的是降低转染各条件对细胞的毒性。优化的方面主要有：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时细胞密度、转染的过程（培养基、抗生素对细胞的影响），转染后细胞多长时间换液等。(8) RNAi效应检测方法效应检测方法mRNA水平：最简单和灵敏的检测方法是用qRT-PCR，一般在转染后24h-48h检测。蛋白水平：常见的是Western Blot、免疫荧光