DNA限制性内切酶分生讨论

1、主讲：叶晨 陈炳宏（麻醉1201） 每当我走进父亲的办公室，总会看见他桌上放着的一些培养皿，里面装的是菌群。它们就象一个住着许多居民的城市，在每一种细菌中都有一个国王，他长得瘦瘦的、高高的。国王有很多仆人，这些仆人长得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父亲把国王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。国王就像一本书，仆人们做的每一件事情在这本书中都有记载。对于我们人类来说，国王记载的这些细目是个谜。 我爸爸已经发现了其中的一个仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外国国王来侵犯一个细菌，这个仆人就会把他剪成小碎片，但他不会对自己的国王造成任何伤害。 聪明的人类用这个带着剪刀的仆人来探究国王的秘密，他们搜集了很多带

2、剪刀的仆人，并把他们放进一个国王里，这个国王就被剪成了碎片。用这种方法得到的小碎片使人类探究国王的秘密变得容易了。爸爸就是因为发现了带着剪刀的仆人而获得了诺贝尔奖。 限制性核酸内切酶发现限制性核酸内切酶发现 这是瑞士微生物遗传学家W阿尔伯（1929）的女儿西尔维娅（当时10岁）在听完父亲给她讲完限制性内切酶后写下的一个故事，限制性内切酶就是故事中带剪刀的仆人。 限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。因此，限制性内切酶被称为“分子剪刀”，它可以完整地切下个别基因。 1965年，阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在具有切割基因功能的限制性内切酶。并于19

3、68年成功分离出I型限制性内切酶，但这种酶的切割基因功能不理想。1970年，美国分子生物学家、遗传学家HO史密斯（1931）分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D内森斯（1928）使用II型限制性内切酶首次完成了对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现人工基因重组提供了有效的技术手段，他们于1978年获得诺贝尔生理学或医学奖。 DNA限制性内切酶原理酶切反应实验步骤影响因素结果分析讨论核酸限制性内切酶（restriction enzyme）是一类能识别双链DNA特定碱基序列的核酸水解酶。能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键。特异位点：特定的碱基序列

4、，通常是46个碱基对、具有回文序列的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA分子，产生5或3粘性末端。磷酸二酯键：一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯化形成的两个酯键。该酯键成了两个醇之间的桥梁。例如一个核苷的3羟基与另一个核苷的5羟基与同一分子磷酸酯化，就形成了一个磷酸二酯键。一、实验原理一、实验原理限制性核酸内切酶都是在原核生物中发现的，可以为宿主抵御外来DNA的侵袭。根据酶的切割特性、催化条件及是否具有修饰性可分为I、II、III型三大类。I型酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。其内切酶的识别位点和切割部位不一致，相距几千个碱基，无固定的切割位点，不产生特

5、异片断。III型酶和I型酶类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活性。此类酶可在DNA链的特异位点切割，但切割位点在识别位点之外，一般相距几十个碱基，对基因工程的意义也不大。分类分类 II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内进行切割，产生特异的DNA片断。 II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序列，但其作用是负责对识别序列的甲基化修饰。 基因工程中使用的DNA限制性内切酶 II型限制酶切割DNA双链可产生三种不同的DNA末端：平末端、5端

6、突出的粘性末端、和3端突出的粘性末端。BamH I识别及切割位点： 5GGATC C3 3C CTAGG5 5G3 5GATCC3 3CCTAG5 3G5Xho I识别及切割位点：5CTCGA G3 3G AGCTC5 二、二、限制性内切酶酶切反应1.配制反应体系 DNA：必须具备一定纯度，微量的酚、氯仿、大于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的重要因素。 反应缓冲液：不同厂家、不同的酶都有不同的最佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。 反应容积：在DNA浓度0.4g/l的情况下，

7、根据后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓度的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散，并降低酶活性。 内切酶及使用的酶量根据实验要求选择限制性内切酶。1个酶活力单位的定义：在50l反应体系中，1gDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1个小时，被完全酶切所需要的内切酶的量。过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的酶量。加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的10%。否则甘油终浓度将达到5%以上，将抑制酶的活性。 2.酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星活性。星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在

8、某些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的现象。其结果是酶切条带增多。星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星活性。 3.终止反应：可以通过以下3种方式终止酶切反应： 若DNA在酶切后不进行进一步的酶反应时，可加入EDTA至终浓度10mM，或加入0.1%SDS。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难。 若DNA在酶切后须进行下一步的酶反应，可将反应产物置65或80加热20分钟。但有些酶加热灭活不彻底。 用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。4.酶切结果的鉴定 酶切完成后，取适量反应液进

9、行琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。 1.按顺序，在1.5ml微量离心管中配制反应试剂： 10X Buffer（缓冲液）5l DNA (100ng/l)（质粒） 44l BamH I (15Units/l)0.5l Xho I (10Units/l)0.5l2.混匀试剂。将离心管置37水浴，反应1小时。三、三、实验步骤微量移液枪将微量离心管置于适当支撑物上面（如插在泡沫塑料板上面）3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段 制备1%琼脂糖凝胶。 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓冲液，混匀。 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样27.5l。 135V衡压电泳30-40分钟。 在紫外灯下观察酶切条

10、带。 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 置-20保存。 四、影响因素内切酶：内切酶：n不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；污染；n注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；n内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常通常 1u1u指在适当条件下，指在适当条件下，1 1小时内完全酶解小时内完全酶解ugug特定特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以以ug DNAug DNA对

11、对u u酶短时间为宜。酶短时间为宜。n同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；切酶活力；n内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。操作中对内切酶的污染。 n作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、能含酚、氯仿、乙醚、SDSSDS、EDTAEDTA、高盐浓度、酒精等，这、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。些因素的

12、存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。n这种抑制可通过：这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（增加酶作用单位数（1020U/ug DNA1020U/ug DNA）、）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。或延长反应时间加以克服。： n反应缓冲液主要由反应缓冲液主要由TrisTrisHClHCl、NaClNaCl、Mg2Mg2+ +组成，其中组成，其中Mg2Mg2+ +为内切酶辅基；为内切酶辅基；nTrisTrisHClHCl维持反应体系维持反应体系pHpH值在值在7.2-7.67.2-7.6之间；之间；nNaClNaCl浓度不同形成种级别的离子

13、强度：浓度不同形成种级别的离子强度： 低盐（低盐（10mM NaCl)10mM NaCl) 中盐（中盐（50mM NaCl50mM NaCl） 高盐（高盐（100mM NaCl100mM NaCl）n 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。反应缓冲液：反应缓冲液： n大多数限制酶反应温度为大多数限制酶反应温度为，如，如EcoR, Hind, EcoR, Hind, BamH, PstBamH, Pst等，也有如等，也有如BclBcl需在需在下进行反应，下进行反应，n反应时间根据酶的单位与用量之比来定，原则反应时间根据酶的单位与用量之比来定，原则是酶：是酶：=：n1

14、212小时即可充分酶解。小时即可充分酶解。酶解温度与时间：酶解温度与时间：五、酶切结果 1 2 31 1泳道泳道 makermaker2 2泳道泳道 质粒质粒DNADNA3 3泳道泳道 酶切产物酶切产物 从电泳结果可以看出，第三泳道出现两个区带，第二泳道只有一个比较宽大的区带，也就是说，限制性核酸内切酶将质粒切割成了性质不同的两部分，说明了限制性核酸内切酶对DNA的切割活性。六、分析讨论一、如果DNADNA完全没有被内切酶切割？完全没有被内切酶切割？原因原因1. 1.内切酶失活内切酶失活2.2.DNADNA不纯，含有不纯，含有SDSSDS，酚，酚，EDTAEDTA等内切酶抑制因子等内切酶抑制因

15、子3.3.条件不适（试剂、温度）条件不适（试剂、温度）4.4.DNADNA酶切位点上的碱基被酶切位点上的碱基被甲基化甲基化5.5.DNADNA酶切位点上没有甲基酶切位点上没有甲基化（如化（如Dpn IDpn I）6.6.DNADNA位点上存在其它修饰位点上存在其它修饰7.7.DNADNA不存在该酶识别顺序不存在该酶识别顺序对对策策1. 1.标准底物检测酶活性标准底物检测酶活性2.2.将将DNADNA过柱纯化，乙醇沉淀过柱纯化，乙醇沉淀DNADNA3.3.检查反应系统是否最佳检查反应系统是否最佳4.4.换用对换用对DNADNA甲基化不敏感的同裂甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒酶酶解，重新将质

16、粒DNADNA转化至转化至dcm-dcm-，dam-dam-基因型的细菌菌株基因型的细菌菌株5.5.换用不同切割非甲基化位点的同裂换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化酶消化DNADNA（如（如San3A ISan3A I代替代替Dpn Dpn I) I)，重新将质粒转至，重新将质粒转至dcm+ dam+dcm+ dam+菌菌株中扩增株中扩增6.6.将将DNADNA底物与底物与DANDAN混匀进行切混匀进行切割验证割验证7.7.换用其它的酶切割换用其它的酶切割DNADNA或过量酶或过量酶消化进行验证消化进行验证二、如果DNA切割不完全？原因原因1. 1.内切酶活性下降内切酶活性下降2.2.内切酶

17、稀释不正确内切酶稀释不正确3.3.DNADNA不纯，反应条件不佳不纯，反应条件不佳4.4.内切酶识别的内切酶识别的DNADNA位点上的碱位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰基被甲基化或存在其它修饰5.5.部分部分DNADNA溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上6.6.内切酶溶液粘度大，取样不准内切酶溶液粘度大，取样不准7.7.酶切后酶切后DNADNA粘末端退火粘末端退火8.8.由于反应溶液、温度、强烈振由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性荡使内切酶变性9.9.过度稀释使酶活性降低过度稀释使酶活性降低10.10.反应条件不适反应条件不适11.11.识别位点两侧插入了可影响酶识别位点两侧插入了可影响酶切

18、效率的核酸顺序切效率的核酸顺序对对策策1. 1.用用5-105-10倍量过量消化倍量过量消化2.2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶酶3.3.同上同上4.4.同上同上5.5.反应前离心数秒反应前离心数秒6.6.将内切酶稀释，增大取样体积将内切酶稀释，增大取样体积7.7.电泳前将样品置电泳前将样品置6565保温保温5-105-10分钟，取出后置冰浴骤冷分钟，取出后置冰浴骤冷8.8.使用标准反应缓冲液及温度，使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡避免强烈振荡9.9.适当稀释酶液，反应液稀释的适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏酶不能贮藏10.10.使用最佳反应体系使用最佳反应体系11.11.加大酶量加大酶量5-