第1章 酶催化反应动力学

1、第一章酶催化反应动力学第一节第一节酶催化反应原理酶催化反应原理酶和一般催化剂的共性酶和一般催化剂的共性n能够改变化学反应的速度，但是不改变化学反能够改变化学反应的速度，但是不改变化学反应平衡。应平衡。n酶本身在反应前后不发生变化。酶本身在反应前后不发生变化。n降低反应的活化能，加速反应的进行。降低反应的活化能，加速反应的进行。酶作为生物催化剂的特性酶作为生物催化剂的特性n高效性高效性n高度专一性：反应专一性，底物专一性高度专一性：反应专一性，底物专一性n酶的催化活性可被调控酶的催化活性可被调控n易变性和失活：强酸、强碱、高温等，故易变性和失活：强酸、强碱、高温等，故反应反应条件温和：一般在条件

2、温和：一般在pH5pH58 8水溶液中进行，反应水溶液中进行，反应温度范围为温度范围为20204040 C C。酶的活性中心n非必需基团非必需基团n必需基团必需基团n活性部位（活性中心）活性部位（活性中心）n接触基团接触基团n结合基团（结合中心）结合基团（结合中心）n催化基团（催化中心）催化基团（催化中心）n辅助基团辅助基团酶的专一性机制n锁钥学说n诱导契合学说酶的高效性机制n广义的酸碱催化n共价催化n邻近效应和定向效应n扭曲变形和构象变化n多元催化和协同效应第二节第二节 单底物酶催化反应动力学单底物酶催化反应动力学121kkkSEESEP 一、米氏方程的建立一、米氏方程的建立n速率控制步骤速

3、率控制步骤121kkkSEESEP 1、快速平衡、快速平衡假设假设n限速步骤限速步骤n快速平衡快速平衡n酶的总量保持不变酶的总量保持不变动力学方程02maxsESSSSSSk C CrCrKCKC2、“拟稳态拟稳态”假设假设活性中间复合物浓度的时间变化曲线n活性中间复合物的浓度不随时间变化活性中间复合物的浓度不随时间变化n酶的总量保持不变酶的总量保持不变maxsSmSrCrKC 二、米氏方程的特征-动力学特征n米氏常数米氏常数n最大反应速率最大反应速率n n一级反应一级反应n零级反应零级反应n（1）、活性中心被底物占据一半时的底物浓度。当V=1/2Vmax时，Km=S。n（2）、Km是特征常数

4、，一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。n（3）、Km可近似表示表示酶与底物的亲和力nKm=(K2+K3)/K1=Ks+K3/K1n当K1、K2K3时，Km近似等于Ks，因此，1/Km可近似表示酶与底物的亲和力大小n（4）、Km与天然底物nKm最小或最高Vm/Km比值的底物称之为该酶的最适底物或天然底物。n（5）、已知Km，可根据S推算V，或由V推算Sn（6）、了解酶的Km及S推知是否受S调节n（7）、用于鉴别原级同工酶、次级同工酶。n（8）、测定不同抑制剂对某个酶的Km值的影响判断抑制类型（非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速

5、度不变。）n（9）、催化可逆反应的酶：测定Km和S推测催化反应的方向及程度。：研究反应速率和反应进程：研究反应速率和反应进程间的关系。间的关系。n一级反应一级反应: :反应速率只与反应物的浓度的反应速率只与反应物的浓度的一次方成正比。一次方成正比。n二级反应二级反应: :反应速率与反应物浓度的二次反应速率与反应物浓度的二次方方( (或两种物质浓度的乘积或两种物质浓度的乘积) )成正比。成正比。n零级反应零级反应: :反应速率与反应物浓度无关。反应速率与反应物浓度无关。 酶促反应动力学酶促反应动力学 1913年年Michaelis和和Menten推导了米氏方程推导了米氏方程 SKSVvmmax

6、Michaelis-MentenMichaelis-Menten方程方程(1913(1913年年) )米氏方程的特征n酶和底物的重要性nA反应速率和酶浓度的关系n反应物足够多的时候,反应速率和酶的浓度成正比 因为酶的催化机理是和底物结合,反应物足够多的时候,酶越多反应越快,而且这个规律接近正比的规律 nB反应速率和底物浓度的关系n在底物浓度很低时，反应反应速度随底物浓度的底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系关系，表现为一级反应反应。随着底物浓度的底物浓度的升高，反应反应速度不再呈正比例加快，反应反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应反应速度不再增加，表现为0级反应反应。此时

7、，无论底物浓度增加多大，反应反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。 ncs Km，酶大部分复合态；水平线，零级反应n介于两者之间时，双曲线，混合级米氏常数（米氏常数（KmKm）的意义）的意义nKm：反应速度为最大速度一半时的底物浓度。：反应速度为最大速度一半时的底物浓度。nKm是酶的一个的特征常数。是酶的一个的特征常数。(底物、温度，底物、温度，pH、离子强度离子强度)nKm可判断酶的专一性和天然底物。可判断酶的专一性和天然底物。nKm可表示酶与底物的亲和力。可表示酶与底物的亲和力。n从从Km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需

8、的的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度底物浓度。nKm值可以帮助推断某一代谢反应的值可以帮助推断某一代谢反应的方向方向和和途径途径及及代谢反应链的代谢反应链的限速步骤限速步骤。 1.Km1.Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。有关，与酶的浓度无关。 2.Km2.Km除了与底物类别有关，还与除了与底物类别有关，还与pHpH、温度有关，、温度有关，所以所以KmKm是一个物理常数，是对一定的底物、一定是一个物理常数，是对一定的底物、一定的的pHpH、一定的温度而言的。、一定的温度而言的。 3.3.如酶能催化几种不同的底物，对每种底物

9、都有如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的一个特定的KmKm值，其中值，其中KmKm值最小的称该酶的最适值最小的称该酶的最适底物。底物。 Km= （k2 +k3)/k1Km k2 / k1S + EESE + P Km可以看作可以看作ES的解离常数的解离常数ks ：Km= ks = SEESk1k2k3当当k2k3时时4.Km4.Km与与KsKs：KmKm不等于不等于KsKs，只有在特殊情况下，只有在特殊情况下，KmKm才可表示酶才可表示酶 和底物的亲和力。和底物的亲和力。 5. 当反应速度达到最大反应速度的当反应速度达到最大反应速度的90%，则，则90%Vmax =100%Vma

10、x S/(Km +S)v = Vmax SKm + S即即 S = 9Km在进行酶活力测定时，通常用在进行酶活力测定时，通常用4Km的底物浓度即可。的底物浓度即可。6. Km可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径:丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乙酰乙酰CoA乙醛乙醛乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（1.710-5）丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶（1.310-3）丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶（1.010-3）当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于Km最小的酶最小的酶。三、动力学参数的求解（rmax、Km）图解法L-B法E-H法积分法最小二乘法双倒数

11、法(Linewear Burk): 对米氏方程两侧取倒数，得 ,以 作图，得一直线，直线斜率为 ，截距为 ,根据直线斜率和截距可计算出Km和rmax。 SmCrKrr111maxmax SCr11max1rmaxrKm1、LB作图法缺点是误差较大主要是因为在低底物浓度时取倒数误差较大。 林-贝氏方程式 2、EH作图法Eadie-Hofstee法法3、HW作图法=Langmuir作图法 n朗格缪尔(Langmuir Itying) (1881-1957)，美国人，著名物理化学家，界面化学的开拓者，1932年诺贝 n尔化学奖获得者.朗格缪尔于1881年1月31日生于美国纽约。毕业于哥伦比亚大学采矿

12、系。1903年为采矿工程师。此后，去德国留学，在格丁根大学研究院攻读博士学位，在著名化学家能斯特教授的指导下，研究铂丝对各种气体的分解作用，1906年获得格丁根大学哲学博士学位。 nH-W法的优点是：数据分布均匀，减少了实验误差，可以提供准确的动力学参数。4、E-C-B作图法=直接线性作图法作图法最好的一般是直接线性作图法 n纵坐标，rmaxn横坐标，Kmn对每一个实验点，作一条直线，横坐标截距为-csn 纵坐标截距为rsn这样，每个实验点标在图上就为一条直线。有几个实验点就有几条直线，理论上，当ce0和其他条件固定时，所有的直线共点。该公共点的坐标即为所求的动力学参数。实际上，实验时，该点在

13、一个范围，均值即为最佳参数值。n上述四种方法均需要求出不同浓度cs条件下的速率rs，而rs的求取一般需要用微分法，因此，上述方法统称为微分作图法。n此外，还有积分作图法，但不做要求。第三节第三节 有抑制的酶催化反应动力学有抑制的酶催化反应动力学 什么是酶的什么是酶的抑制作用抑制作用和和失活作用失活作用？ 失活作用：失活作用：酶变性；酶活性丧失（无选择性）酶变性；酶活性丧失（无选择性）。 抑制作用：抑制作用：使酶的必需基团的化学性质改变而使酶的必需基团的化学性质改变而降降低酶活性甚至使酶完全丧失活性的作用，引起作用低酶活性甚至使酶完全丧失活性的作用，引起作用物质称为物质称为（I I）（选择性）。

14、）（选择性）。 酶的抑制作用n不可逆抑制不可逆抑制n可逆抑制可逆抑制n竞争性抑制竞争性抑制n非竞争性抑制非竞争性抑制n反竞争性抑制反竞争性抑制 抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合, , 使酶丧失活性使酶丧失活性, , 不能用透析超滤等物理方法除去不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性抑制剂使酶恢复活性. .1.1.不可逆抑制不可逆抑制（irreversible inhibitionirreversible inhibition）羟基酶羟基酶: : 以丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶；有机磷以丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶；有机磷( (敌百虫、

15、敌敌畏、对硫磷敌百虫、敌敌畏、对硫磷) )不可逆抑制羟基酶的活性中心不可逆抑制羟基酶的活性中心 2.2.可逆抑制作用可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制剂与酶的必需基团以非共价键结合抑制剂与酶的必需基团以非共价键结合, , 使酶降低或丧失活性使酶降低或丧失活性, , 可用透析超滤可用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性。等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性。 E + S ES E + P + Ki EKi=E*I/EI, Eo=E + EI + ES竞争性抑制作用（竞争性抑制作用（competitive inhibitioncompetitive inhibitio

16、n） Sn抑制剂和底物竞争与酶结合，防碍了底物与酶抑制剂和底物竞争与酶结合，防碍了底物与酶的正常结合。的正常结合。n竞争机制：竞争同一位点竞争机制：竞争同一位点 竞争不同位点，但防碍竞争不同位点，但防碍S S与与E E结合结合 E E和和I I结合后引起酶结合部位构象变化结合后引起酶结合部位构象变化n竞争抑制特点：竞争抑制特点：Vmax Vmax 不变，不变，KmKm增大增大 增大增大SS可减轻或消除抑制作用可减轻或消除抑制作用n决定竞争性抑制程度的因素决定竞争性抑制程度的因素 II和和SS的相对浓度比例的相对浓度比例 ESES和和EIEI的相对稳定性的相对稳定性( () ) E + S ES

17、 E + P + Ki + Ki E ES Eo=E + ES+ EI + ESI 非竞争性抑制作用（非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibitionnoncompetitive inhibition） E+S ES ESI E+S ES ESI IE+I EI ESI E+I EI ESI SIIIIn抑制剂和底物同时与酶结合而抑制酶活性，抑制剂和底物同时与酶结合而抑制酶活性，I I和和S S之间不存在竞争关系。之间不存在竞争关系。 如如Ag Ag + +、 Cu Cu 2+2+、 Hg Hg 2+2+和和 PbPb2+2+对酶的抑制。对酶的抑制。n作用机制：作用机制：

18、I I和和S S结合在酶的不同部位；结合在酶的不同部位；I I作用作用于于E E催化基团。催化基团。n非竞争性抑制的特点：非竞争性抑制的特点：Vmax Vmax 减小，减小，KmKm不变；不不变；不能用增加底物的方法来解除抑制。能用增加底物的方法来解除抑制。n抑制程度取决于抑制程度取决于II大小。大小。 E + S ES E + P + Ki ES Eo=E + ESI + ESIIn抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性，即活性，即I只与只与ES结合。结合。n反竞争性抑制的特点：反竞争性抑制的特点：Vmax 和和Km都减小都减小n抑制程度取决

19、于抑制程度取决于I和和ES二者的浓度。二者的浓度。一、竞争性可逆抑制动力学动力学方程式与参数SmISSIImSSICKCrCKCKCrrmaxmax)1 (动力学特点 动力学参数的求解动力学参数的求解（续） I 正常正常1v1 S1 Vmax-1Km(1+ )I Ki-1 Km二、非竞争性抑制121kkkESESEP 33kkEIEI 44kkESISEI 55kkEISSEI 动力学方程式SmSISmIISESSICKCrCKKCCrCkrmax,max2)(1 (动力学特点动力学参数的求解动力学参数的求解（续）IIIIICKrrrKCrmaxmaxmaxmax,1111三、反竞争性抑制 动

20、力学方程式SImSIESSICKCrCkrmax,2mmIIKrKrmaxmax,动力学特点动力学参数的求解动力学参数的比较 四、底物抑制PEESSEkkk21133SESESSkk动力学方程式SSSmSSSKCCKCrr2max底物抑制反应的优化SmSoptKKC一些重要的抑制剂及其实际意义一些重要的抑制剂及其实际意义 1 1、不可逆抑制剂：、不可逆抑制剂：E+IEI E+IEI POOXOR1R2POOXR2R1或或 有机磷化合物有机磷化合物 化学结构通式化学结构通式: : R R1 1、R R2 2 : : 烷基烷基 ; X: -F, -CN; X: -F, -CN等等（1 1）非专一性

21、不可逆抑制剂）非专一性不可逆抑制剂 这些有机磷化合物能抑制某些蛋白酶及这些有机磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，特别是强烈抑制胆碱酯酶。酯酶的活力，特别是强烈抑制胆碱酯酶。 胆碱胆碱 乙酸乙酸乙酰胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱酶乙酰胆碱酶胆碱酯酶胆碱酯酶 有机磷化合物中常用的是有机磷化合物中常用的是DFPDFP以及有机磷以及有机磷杀虫剂，如杀虫剂，如16051605、敌百虫、敌敌畏、乐果等。、敌百虫、敌敌畏、乐果等。 巯基酶抑制剂巯基酶抑制剂 什么是巯基酶？什么是巯基酶？ A A、烷化剂：例、烷化剂：例 ICHICH2 2COOHCOOH，ICHICH2 2CONHCONH2 2等等 B B、有机汞

22、、有机砷化合物、有机汞、有机砷化合物 C C、巯基氧化剂、巯基氧化剂 2E-SH + GSSG 2E-SH + GSSG E-S-S-E + 2GSH E-S-S-E + 2GSH E-S H + ICHE-S H + ICH2 2COOHCOOHE-S-CHE-S-CH2 2COOH + HICOOH + HICOOHHgSE+ HClE-S H +COOHHgCl2 E-S H +AsROAsRSSEE+ H2O 金属酶抑制剂金属酶抑制剂 什么是金属酶？什么是金属酶？ 金属酶抑制剂如氰化物、硫化物和一氧化碳等。金属酶抑制剂如氰化物、硫化物和一氧化碳等。 重金属抑制剂重金属抑制剂 如含如含A

23、gAg+ +、CuCu2+2+、HgHg2+2+、PbPb2+2+等金属盐能等金属盐能使大多数酶失活。使大多数酶失活。 第四节第四节 复杂的酶催化反应动力学复杂的酶催化反应动力学一、可逆酶催化反应动力学n反应机理反应机理PEESSEkkkk2211PPmSPPPSmKCKCCKrCKrr1)()(max二、双底物酶反应动力学n顺序机制顺序机制n乒乓机制乒乓机制n随机机制随机机制双底物双产物反应双底物双产物反应 A+BA+BP+Q P+Q 双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类 : :双底物双底物 双产物双产物反应反应 序列反应序列反应sequent

24、ial sequential reactions reactions 乒乓反应乒乓反应 ping pong ping pong reactions reactions 有序反应有序反应 ordered ordered reactions reactions 随机反应随机反应 random random reactions reactions (1)(1)序列有序反应（序列有序反应（ordered reactions ordered reactions 写作写作 ordered Bi Biordered Bi Bi） 1.1.序列反应（序列反应（ordered reactions ,ordere

25、d reactions ,或单或单- -置换置换反应）反应） E + A + B AEB PEQ E + P + QE + A + B AEB PEQ E + P + Q(2)(2)序列随机反应（序列随机反应（random reactionsrandom reactions， 写作写作Random Bi BiRandom Bi Bi） 2 2乒乓反应（乒乓反应（ping pong reactionsping pong reactions，或双，或双- -置换置换反应写作反应写作uni uni uni uni ping pong or Ping uni uni uni uni ping pong

26、 or Ping Pong Bi BiPong Bi Bi） 三、变构酶催化反应动力学n动力学方程式动力学方程式nSHnSSCKCrrmax参数的求取第五节第五节 反应条件对酶催化反应条件对酶催化反应速率的影响反应速率的影响一、pH的影响酶酶的的活活性性A: 胃蛋白酶胃蛋白酶; B: 葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶磷酸酶AB 最适最适pHpH与最适温度一样，也不是一个固定与最适温度一样，也不是一个固定的常数，它随底物的种类、浓度的常数，它随底物的种类、浓度, ,溶液的离子溶液的离子强度、强度、pH,pH,反应时间等的影响。反应时间等的影响。一些酶的最适一些酶的最适 pH pH 值值 酶酶 最适最适

27、pHpH胃蛋白酶胃蛋白酶 1.81.8过氧化氢酶过氧化氢酶 7.67.6胰蛋白酶胰蛋白酶 7.77.7延胡索酸酶延胡索酸酶 7.87.8核糖核酸酶核糖核酸酶 7.87.8精氨酸酶精氨酸酶 9.89.8碱性磷酸酶碱性磷酸酶 10.510.5pHpH对酶作用的影响机制：对酶作用的影响机制：1.1.酸、碱可使酶变性或酸、碱可使酶变性或改变构象失活；改变构象失活；2.2.影响酶活性基团的解离；影响酶活性基团的解离；3.3.影影响底物的解离，响底物的解离，4.4.影响影响ESES的解离。的解离。反应机理式二、温度的影响温度对唾液淀粉酶活性的影响温度对唾液淀粉酶活性的影响产产物物麦麦芽芽糖糖的的毫毫克克数数 最适温度不是一个固定的常数，它受底物最适温度不是一个固定的常数，它受底物的种类、浓度的种类、浓度, ,溶液的离子强度、溶液的离子强度、pH,pH,反应时间反应时间等的影响。等的影响。例例: : 反应时间短，最适温度高。反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。反应时间长，最适温度低。温度系数：温度系数： 当温度增高当温度增高1010摄氏度，反应速度与原来摄氏度，反应速度与原来反应速度的比。对于大多数酶