SSR分子标记实验操作注意事项_图文

1、第30卷第11期2011年11月 种子(Seed V01.30No.11Nov.2011经验交流SSR分子标记实验操作注意事项戴剑,吴燕(江苏省农业科学院粮食作物研究所,南京210014Attention of SSR Molecular Marker in Experiment摘要:SSR分子标记已经得到普遍应用,初学者如不能很好地 掌握实验操作要点,就难以在较短时间内成功地获得试验结 果。本文分别介绍了DNA提取、PCR扩增和电泳检测PCR扩 增产物等实验过程中容易被忽视的注意事项,以期为普及SSR 分子标记实验技术服务。关键词:SSR;DNA提取;PCR扩增;电泳;注意事项中图分类号:S

2、 131+.2文献标志码:B文章编号110014705(201111-0122-02SSR(Simple Sequence Repeats又称微卫星DNA, 是一类由几个(多为16个碱基组成的基序(motif 串联重复而成的DNA序列,其长度一般较短,它们广 泛分布于整个基因组的不同位置上,每个座位上重复 单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同,因 而造成了每个座位上的多态性¨J。SSR标记数量丰 富,覆盖整个基因组,而且分布均匀,多态性高,呈共显 性遗传,重复性好,操作简便,是一种理想的分子标记 技术,被广泛应用于构建基因连锁图、分子辅助育种、 品种鉴定、遗传资源的保存等方面。

3、然而,对于初学 者,由于不能较好地掌握实验操作技能和注意事项,往 往不能一次获得试验的成功,需要经过多次反复的试 验才能达到预期的结果,这样不仅耽误了试验时间,而 且浪费了大量昂贵的分子实验试剂。然而,大多数文 献仅着重分析试验的结果,只是简单地介绍试验方法, 甚至会省略试验方法,因此,作者根据多年的实践经 验,对SSR分子实验中的一些容易被忽视的注意事项 加以总结,以期能给初学者提供借鉴。1DNA提取过程中的注意事项目前常用的DNA提取方法有SDS和CTAB法忙J, 也有学者改进了DNA提取方法,有简易DNA提取方收稿日期:201l一0625基金项目:江苏省农业科学院科研基金(6110830

4、。作者简介:戴剑(1968一,女,江苏靖江人;副研究员,博士,主要从事 种子质量与植物新品种测试研究工作;E.mail:d画ian842 。122 法3,41和快速DNA提取方法呤1。无论使用哪种方法, 均需要注意以下常见的操作事项I(1避免试验材料间DNA的交叉污染或外来 DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法,可以将每个样品 在单独的离心管中研磨,研磨使用的小钢珠球最好是 一次性的,如果是反复使用的小钢珠球,必须彻底清洗 干净。使用液氮和研钵研磨叶片组织时,必须在每次 研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒。(2试验材料应选取幼嫩组织,因为植物幼嫩组 织DNA含量高,且多糖、多酚含量少。(3装入离心管的

5、叶片组织最好不要超过离心管 的1/31/2,否则会引起细胞裂解不完全,导致DNA 产量和纯度下降。(4使用液氮研磨时,要先将研钵用液氮冷却,在 加入液氮后,要先将叶片压碎,研磨时要快速用力,尽 量使样品磨成粉末状。(5水浴前需要确保试管盖盖严,或使用辅助工 具进行加固,以防止水浴时因温度较高导致试管盖 开裂。(6水浴过程中,每隔1015min将离心管取出 振荡、摇匀,使粉碎的叶片组织尽量与裂解液充分接 触,破坏细胞结构,释放DNA。(7实验过程中振荡动作不宜剧烈,移液枪头最 好使用大孔枪头,移液动作不能太快,以免使DNA 断裂。(8当DNA以小球状固体沉积在离心管底部后, 倾倒离心管中多余液体

6、时,应避免把DNA小球一起倒 出。可在倒去大部分液体后,改用吸水纸吸取剩余 液体。(9DNA风干最好在无菌操作台上进行,待乙醇 彻底风干后才能加入TE或ddH:O溶解,如果有残留 的乙醇,可能会影响PCR反应的试验结果。(10如果DNA纯度不好i可将DNA粗提物用 1XTE溶液充分溶解,离心后,取上清液再次沉淀万方数据经验交流 戴剑等:SSR分子标记实验操作注意事项DNA,可有效除去多糖。2PCR反应实验操作注意事项PCR反应过程中应特别注意不要使样品相互污 染,以免造成试验结果不准确,同时也要注意所加试剂 或样品必须是经过混匀后的液体,这样才能保证反应 液各成分的浓度和体积的均一性。所用试剂

7、需从正规 商家购进,以保证试剂的质量。(1尽量使用一次性手套、专用整套移液器、成套 试剂和其他必需品,避免外来DNA污染反应体系。 (2DNA模板应稀释为适宜的浓度,使加入PCR 反应的DNA样品体积最好在45肛l。如果DNA模 板样品量太少,仅有12础,不仅实验操作难度大,而 且如果操作时间长,会导致DNA反应液部分或全部蒸 发掉,影响PCR反应结果。(3可以先将DNA样品加到PCR管底部,再加其 他PCR反应混合液。加样时选择不同的方位加DNA 模板和其他PCR反应混合液,这样枪头靠壁加样时不 会交叉污染。(4加样完毕后,盖上盖子,混匀反应液,再低速 离心片刻(1min左右。如果不是立即进

8、行PCR扩 增,需将PCR反应混合液置于一20保存备用。 (5PCR扩增反应使用的酶不能长时间放置于室 温下,须随用随取,使用完毕后立即放回一20冰箱。 否则,酶易失活。(6PCR反应的退火温度应根据不同的引物来确 定最佳退火温度,以确保扩增的条带中杂带少,目标带 明显,引物退火温度一般按照Tm=4(G+C+2 (A+T公式计算。3电泳操作注意事项(1对于缓冲系统,在没有离子存在时,电导率最 小,DNA不迁移,或迁移极慢,在高离子强度的缓冲液 中,电导很高并产热,可能导致DNA变性,因此应注意 缓冲液浓度的正确使用。(2电泳所需溶液需现配现用,配制10%AP(过 硫酸铵时,可大量配好后,分装到

9、1.5IIll的离心管 中,在一20条件下保存,每次使用前解冻所需使用 量即可5|。(3DNA迁移率取决于凝胶的浓度、迁移分子的 形状及大小,制备凝胶根据PCR扩增产物分子量的大 小范围来决定凝胶的浓度。(4在制胶时应避免有残留气泡,拔梳子时,要先 将缓冲液漫过加样孔,避免空气进入,并且要垂直向上 拔出梳子。(5样品的加样量多少根据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定,量过多会造成加样孔超载, 从而导致拖尾和弥散,对于分子量较大的DNA,此现 象更明显。(6加样的时间不能太长,否则会导致样品扩散 而被稀释,影响电泳效果。(7在使用电压一致的情况下,电泳效果的好坏, 与电泳时间有着很大关

10、系,电泳时间过长会导致扩增 条带间的距离大,不利于读带,而且条带的清晰度也会 下降,甚至会产生电热效应,促使扩增条带出现“微 笑”o情况。电泳时间过短,会降低电泳条带的分辨 率。一般聚丙烯酰胺凝胶最佳电泳时间为6090 min,琼脂糖凝胶电泳的时间根据DNA片段大小和琼 脂糖凝胶浓度而定,一般为40120min。(8使用合适的电压和电流进行电泳,常使电压 恒定在200V下进行电泳,琼脂糖凝胶电泳的电压一 般不超过5V/cm。 . (9冰醋酸、硝酸银、氢氧化钠、甲醛等染色试剂, 对环境与人体都有污染、毒害作用,染色须在通风橱中 或在空气流通良好的环境中进行,硝酸银溶液需避光 保存,或现用现配。丙

11、烯酰胺为神经性毒剂,操作时必 须戴手套。(10要尽量减少每次染色的凝胶片数量,太多会 造成重叠,使染色不彻底。(11用水冲洗终止反应后的凝胶时,要特别小 心,避免水直接冲到凝胶表面,使胶破碎。倒掉冲洗水 时,最好用一个漏网挡着,防止凝胶被倒出。参考文献:1陈佩度.作物育种生物技术M.北京:中国农业出版社, 2001:126143.2戴剑,洪德林,张大栋,等.一种快速高效的DNA提取方法 研究J.麦类作物学报,2011,31(3:437442.3孙林静,马忠友,苏京平,等.一种简单快速的DNA提取方 法在水稻上的应用J.天津农学院学报,2007,14(3: 14.4卢振宇,李明顺,谢传晓,等.玉米叶片DNA快速提取方法 改进研究J.玉米科学,2008,16(2:5053.5吉家敏,夏志强,邹枚伶,等.木薯SSR标记非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳条件的优化J.现代农业科学,2009,16 (6