实验四 考马斯亮蓝方法和BCA法

1、实实 验验 四：四：蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定 考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（Bradford）和）和BCA法法实验目的及要求 了解考马斯亮蓝法（Bradford法）和BCA法的原理及干扰因素 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的方法蛋白质检测及含量的测定一、化学检测 1、凯氏定氮法（Kjeldahl)：0.21.0 mg/ml (平均含氮量16%) 2、双缩脲法（Biuret）：110 mg/ml （肽键在碱性溶液中与铜离子络合呈紫红色） 3、Folin-酚试剂法（Lowry）：20-250 mg/ml （干扰因素多） 4、考马斯亮蓝法（Bradford）：10100 mg/ml （受蛋白质内

2、氨基酸组成影响较大） 5、BCA法（bicinchoninic acid二喹林甲酸）：5-200 mg/ml； MicroBCA：0.5-20 mg/ml；二、光学检测1、荧光检测：邻苯二甲醛（OPT）法，强还原剂与氨基酸/肽反应产生强荧光性化合物，激发波长为340nm,荧光波长为455nm，可用于氨基酸自动分析系统。2、紫外光检测：10 mg/ml （芳香族氨基酸残基对280nm的紫外光有最大吸收）三、电泳或免疫化学检测 ：如PAGE、Western Blot、ELISA等考马斯亮蓝 G250（Coomassia Brilliant Blue G-250）能在酸性溶液中与蛋白质的疏水区结合，

3、最大光吸收峰从 405nm变为 595nm，溶液的颜色也从棕黑色变为蓝色，所显示蓝色至少在 1 小时内是稳定的。在一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系。优点：灵敏度高，0-100 mg/ml； 测定快速、简便，颜色可以在1小时内保持稳定; 干扰物质少。 缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；去污剂、甘油、乙酸和0.1 M的NaOH会干扰此法的测定。BCA法 原理BCA（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠，Bicinchoninic acid）能与含二价铜离子的硫酸铜组成BCA工作试剂。在碱性条件下，二价铜

4、离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子与BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色复合物。在562nm处显示强吸光性。在一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系。 优点：准确灵敏,5-200 mg/ml; 测定快速简便；经济实用; 干扰物质少；检测不同蛋白质分子的变异系数远小于Bradford法 缺点：与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够。蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果。每种蛋白质测定法各有其优缺点-在选择方法时应考虑的因素 实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质； 测定所要花费的时间

5、实验内容1、制备蛋白样品；2、分别制作两种测定方法的标准曲线；3、分别用两种方法测定样品。实验流程1 制备总蛋白样品： 小白菜（梗+叶）10 g，碾成匀浆，加水10 ml后继续碾10 min，倒入离心管中，另加20 ml水将剩余物洗入两个50 ml离心管，称重平衡后10000 r/min离心10 min。小心地将少量上清（约1520 ml）倒入小烧杯，取烧杯中上清10 ml定容到100 ml，待测。 用量筒量取剩余上清的体积，计算上清总体积。 管号 ml样品1234567C白菜抽提液标准蛋白质100 mg/ml00.1 0.2 0.4 0.6 0.81XX1X2X3H2O10.9 0.8 0.

6、6 0.4 0.20YY1Y2Y3考马斯亮蓝G-250溶液55555555555混匀，室温 放置10min吸光度值（A595）每管蛋白质的含量（mg）Bradford法 实验表格X+Y=1ml（ 10-100 mg/ml）C为未知浓度蛋白质溶液为未知浓度蛋白质溶液BCA法 实验表格 管号 ml样品123456C白菜抽提液标准蛋白质100 mg/ml00.10.20.40.81XX1X2X3H2O10.90.80.60.20YY1Y2Y3BCA工作液2222222222混匀，60度温育30min，冷却至室温吸光度值（A562）每管蛋白质含量 (mg)X+Y=1ml（ 5-200 mg/ml）C为未知浓度蛋白质溶液为未知浓度蛋白质溶液注 意1、自己制备的蛋白质溶液测定含量时，注意稀释度控制在测定范围内2、蛋白质样品和呈色剂都不应有沉淀，有沉淀应过滤除去3、染料与蛋白质结合后，形成的蓝色复合物易轻度沾附试管壁或比色皿，每次使用不能用有着色的比色皿。使用完后应立即用95%乙醇清洗干净蛋白质标准曲线00.020.040.060.080.10.120.1400.20.40.60.811.2浓度(mg/ml)吸光值(A562)1、比较两种方法测得的小白菜中蛋白质的含量