PCR和DNA测序

1、1PCRPCR和和DNADNA测序技术测序技术2Polymerase Chain Reaction(PCR(PCR，多聚酶链式反应，多聚酶链式反应) )特异片断的体外扩增技术特异片断的体外扩增技术无细胞克隆技术无细胞克隆技术(“free bacteria” cloning (“free bacteria” cloning techniquetechnique）3常用常用PCRPCR仪仪41993年至今：年至今： 计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程操作程序，使之迅速得到推广。序，使之迅速得到推广。 PCR技术是方法学上的一

2、次革命，生物学及医学领域的技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的 一个里程碑，一个里程碑，巨大的推动作用。巨大的推动作用。发展历程发展历程1983年，由年，由Cetus 公司的公司的Kary Mullis 建立建立 http:/ http:/ Saiki等在等在science上详细描述（人珠蛋白上详细描述（人珠蛋白DNA）1988年年 耐热的耐热的Taq DNA聚合酶聚合酶被发现和应用，把被发现和应用，把 PCR推向了实用推向了实用 阶阶段，成为段，成为PCR发展史上又一里程碑发展史上又一里程碑1989年，美国专利局授予年，美国专利局授予PCR技术专利；技术专利； PCR技术被技术被sc

3、ience杂志评选为伟大的技术发明；杂志评选为伟大的技术发明； 1989年为年为DNA聚合酶的分聚合酶的分http:/ 获得诺贝尔化学奖获得诺贝尔化学奖。5类似类似DNADNA在细胞内的复制过程在细胞内的复制过程: : 由一对引物介导由一对引物介导, ,通过温度调节，使双链通过温度调节，使双链DNADNA变成单链（变性）；变成单链（变性）； 单链单链DNADNA能与引物复性（退火）成为能与引物复性（退火）成为 引物引物-DNA-DNA单链复合物单链复合物； 在在dNTPsdNTPs存在下，存在下，DNADNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNADNA（

4、延伸）（延伸）PCRPCR循环：一个循环：一个热变性热变性- -复性复性- -延伸延伸的过程。的过程。通常，通常，20-3020-30个循环之后，可获得大约个循环之后，可获得大约10106 6倍待扩增的倍待扩增的DNADNA片段的片段的拷贝。拷贝。什么是什么是PCR ? ?6DNA在细胞内的复制过程a7DNA在细胞内的复制过程b8DNADNA复制过程中复制过程中,2,2条新生链都只能从条新生链都只能从5 5端向端向3 3端延伸端延伸, ,前导链连续合成前导链连续合成, ,滞后链分段合成滞后链分段合成. .DNA在细胞内的复制过程c9DNA在细胞内的复制过程d10DNA在细胞内的复制过程e111

5、.PCR1.PCR的基本原理的基本原理在离心管中进行的在离心管中进行的DNADNA合成扩增技术，合成扩增技术，模拟染色体的体内复制过程；模拟染色体的体内复制过程；与体内与体内DNA复制的不同之处：复制的不同之处： 耐热的耐热的TaqTaq酶酶取代普通的取代普通的DNADNA聚合酶聚合酶 用用合成的合成的DNADNA引物引物替代替代DNADNA引物引物 温度的调节：温度的调节：变性、退火、延伸变性、退火、延伸 反复循环，可使反复循环，可使DNADNA无限扩增无限扩增12PCRPCR的第的第1 1个循环过程个循环过程13PCRPCR的第的第1 1和和2 2个循环过程个循环过程14PCRPCRPCR

6、的第的第3 3个循环过程个循环过程15PCRPCR技术的使用技术的使用PCRPCR的标准反应程序：的标准反应程序：变性变性- -复性复性- -延伸延伸161)DNA1)DNA模板的解链（变性）模板的解链（变性） 90 95 ，30s 理论上，在理论上，在9090左右左右能使能使DNADNA双链之间的双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；所有氢键链断开，完全分离为单链； 且在且在中性中性pHpH情况下，情况下，DNADNA的完整性仍能很的完整性仍能很好保存好保存172)DNA 2)DNA 单链与引物的退火（复性）单链与引物的退火（复性） 55 65 ，3045s 引物与模板单链特异性结合（较

7、高的温度）；引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNADNA引物的引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+ +模板几率模板几率DNADNA自身复性自身复性 几率几率 ）; 引物的最佳退火温度引物的最佳退火温度Tm-5 ，引物的量引物的量 引物的长度引物的长度183)3)引物的延伸（新链引物的延伸（新链DNADNA的合成）的合成） 7075 ，3060s （0.5mM 10mM1 unit25100l223. 影响影响PCR反应的因素反应的因素 ( 最适条件）最适条件） (1) (1

8、)模板：将要被复制的核酸片段模板：将要被复制的核酸片段 DNADNA或或RNARNA（RNAcDNARNAcDNA） 较高的纯度较高的纯度：最好用纯化的最好用纯化的DNADNA样品，样品， （避免混有蛋白酶、核酸酶）。（避免混有蛋白酶、核酸酶）。 用量合适：用量合适：10102 210105 5分子数（分子数（100ng2kb2kb。26(3)DNA(3)DNA聚合酶聚合酶a.a.大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶的的KlenowKlenow片断片断： 不耐热，每次循环需重加酶。不耐热，每次循环需重加酶。c. c. 其他聚合酶其他聚合酶b.Taqb.Taq酶酶（19881988年）年）：是从温泉耐高

9、温细菌中提取的耐热性：是从温泉耐高温细菌中提取的耐热性DNADNA聚合酶，聚合酶，其活性需要其活性需要Mg2+Mg2+ 。 但但Taq-DNATaq-DNA聚合酶有一定错配率（无聚合酶有一定错配率（无3535外切酶活性，有外切酶活性，有5353外切酶活性），为外切酶活性），为0.1%-0.25%0.1%-0.25%（3030次次cyclecycle）；若要细胞）；若要细胞克隆克隆PCRPCR扩增的产物，进行表达，扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实扩增后必须测序证实才可使用才可使用27CharacteristicsDescriptionOriginMolecular weightOptim

10、al temperatureActivityStabilityFidelityMg2+ concentrationExonuclease activityTransferase activityThermus aquaticus strain YT194 kd72-80150 nucleotides/sec/molecule50% at 95 for 40 min1.110-4 substitutions per cycle0.5mM0.5mM 10mM1 unit25100l1 1、反应体系的优化、反应体系的优化30常用的常用的PCR技术技术v热启动热启动PCRPCRvTD-PCR(touc

11、h down PCR,TD-PCR)TD-PCR(touch down PCR,TD-PCR)v巢式巢式PCRPCRv反向反向PCRPCRv锚定锚定PCRPCRv荧光定量荧光定量PCRPCRvRT-PCRRT-PCRv不对称不对称PCRPCR311 1、热启动、热启动PCRPCRv热启动热启动PCRPCR（hot start PCRhot start PCR）是一种改良的）是一种改良的PCRPCR方法，可有效避免非特异性扩增。方法，可有效避免非特异性扩增。v将将DNADNA聚合酶与其他反应物隔绝，或是使用在高聚合酶与其他反应物隔绝，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，热状况下才会活化的聚合酶

12、，避免在未达到设定避免在未达到设定温度前就开始反温度前就开始反应。应。32热启动热启动PCRPCR有几种方式：有几种方式：v蜡隔绝法：蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反应物加入将除了聚合酶以外的反应物加入PCRPCR管后，加滴管后，加滴熔融的石蜡熔融的石蜡；待石蜡凝固后再加入聚合酶待石蜡凝固后再加入聚合酶。放入。放入PCRPCR仪开始仪开始反应升温后，石蜡融化浮至最顶层，聚合酶才与其他反应物反应升温后，石蜡融化浮至最顶层，聚合酶才与其他反应物混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。 v热启动聚合酶热启动聚合酶（化学型化学型）：经过化学分子修饰的聚合酶，高）：经过化学分子修饰

13、的聚合酶，高热下结构改变而启动。热下结构改变而启动。 v热启动聚合酶热启动聚合酶（抗体抗体）：带有针对聚合酶的免疫抗体，高热）：带有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体分离而启动。下使抗体分离而启动。 v热启动聚合酶热启动聚合酶（共价键结共价键结）：改良自抗体型，使用小分子的）：改良自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离。化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离。 332、TD-PCRv即即touchdown PCRtouchdown PCR，降落降落PCRPCR。v指指每一个（或每一个（或n n个）循环降低个）循环降低11（或（或nn）退火温度）退火温度，直至，直至达到一个

14、较低的退火温度（达到一个较低的退火温度（touchdowntouchdown退火温度）。然后以退火温度）。然后以此温度进行此温度进行1010个循环个循环。v正确和非正确退火温度正确和非正确退火温度11差异将造成差异将造成PCRPCR产物量产物量4 4倍的差异倍的差异，如果相差如果相差55，就会产生，就会产生4 4的五次方（的五次方（10241024）倍的优势，因此，）倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。v退火温度起始在退火温度起始在高于计算的高于计算的TmTm值值1515左右左右，再接下来的循环，再接下来的循环中，退火温度以每次中，退

15、火温度以每次1-21-2逐渐降低，逐渐降低，直到直到TmTm值以下值以下55，当，当达到特异的引物达到特异的引物- -模板结合的模板结合的TmTm值时，扩增就会开始。值时，扩增就会开始。 当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物避免非特异非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物避免非特异扩增产物的出现。扩增产物的出现。v此法扩增此法扩增可利于可利于PCRPCR产物纯化产物纯化。34TD-PCRTD-PCR注意事项注意事项v由于目标是在较早的循环中避免低由于目标是在较早的循环中避免低TmT

16、m值配对，在值配对，在TDTDPCRPCR中中最好应用热启动技术最好应用热启动技术。v设计时，退火温度的范围应跨越设计时，退火温度的范围应跨越1515左右，从高于估左右，从高于估计计TmTm值至少几度到低于它值至少几度到低于它1010。353 3、巢式、巢式PCRPCR Nested PCR Nested PCRv利用两套利用两套PCRPCR引物引物（巢式引物）进行（巢式引物）进行两轮两轮PCRPCR扩增反应。扩增反应。 364 4、反向、反向PCRPCRvPCRPCR只能扩增两端序列已知的基因片段，只能扩增两端序列已知的基因片段，而反向而反向PCRPCR则可扩增则可扩增中间一段已知序列，而两

17、端序列未知的基因片段中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。v方法：先用限制性内切酶酶切样品方法：先用限制性内切酶酶切样品DNADNA， 然后用然后用DNADNA连接酶连接成一个环状连接酶连接成一个环状DNADNA分子，通过分子，通过反向反向PCRPCR扩增引物的上游片段和下游片段；扩增引物的上游片段和下游片段；v反向反向PCRPCR可用于可用于 研究与已知研究与已知DNADNA区段相连接的未知染色体序区段相连接的未知染色体序列（列（染色体缓移或染色体步移）染色体缓移或染色体步移）。37反向反向PCRPCR方法的不足方法的不足v需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的需要从许多酶

18、中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶非酶切位点切断靶DNA。v大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，中的未知功能序列中有时也会有这些序列，因此，反向因此，反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。385 5、锚定、锚定PCRPCRv锚地锚地PCRPCR技术是技术是 用于扩增已知一端序列的目的用于扩增已知一端序列的目的

19、DNADNA。在未知。在未知序列一端加上一段多聚序列一端加上一段多聚dGdG的尾巴，然后分别用多聚的尾巴，然后分别用多聚dCdC和已知和已知的序列作为引物进行的序列作为引物进行PCRPCR扩增。扩增。396、RT-PCRv反转录反转录RCRRCR（reverse transcription PCR,RT-PCRreverse transcription PCR,RT-PCR）v实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR（real time PCR,RT-PCRreal time PCR,RT-PCR）407、RACE技术技术vRACERACE：快速扩增：快速扩增cDNAcDNA末端末端(Rapid

20、Amplification (Rapid Amplification cDNA End)cDNA End)技术，获得全长技术，获得全长cDNAcDNA的快速有效的方法。的快速有效的方法。 vRACERACE法就是通过向法就是通过向cDNAcDNA末端加尾，根据末端加尾，根据已知序列已知序列和和加尾加尾 设计引物扩增设计引物扩增 获取获取cDNAcDNA末端未知序列的方法。末端未知序列的方法。v5 RACE 5 RACE 和和 3RACE3RACE的原理不一样的原理不一样41Takara公司公司3 RACE和和 5 RACE 试剂盒原理试剂盒原理423RACE3RACE的局限性及注意事项的局限性

21、及注意事项v33末端末端RACERACE相对容易，因为存在一个相对容易，因为存在一个poly(A)poly(A)，而且降解，而且降解往往也不是从往往也不是从3 3末端开始的。末端开始的。v局限性：局限性： 细菌和一些病毒的基因组的细菌和一些病毒的基因组的33末端通常没有末端通常没有polypoly（A A），），这个方法就不适用；这个方法就不适用； 而且在有一些而且在有一些RNARNA中，这个中，这个poly(A)poly(A)也容易丢失也容易丢失 解决办法：可以通过解决办法：可以通过poly(A)poly(A)聚合酶在末端加聚合酶在末端加A A即可即可vRNARNA中加入中加入RNARNA酶

22、抑制剂，很有利于保持完整的酶抑制剂，很有利于保持完整的RNARNA43445RACE5RACE的局限性的局限性v通常，提取的通常，提取的RNARNA都会有些降解，而都会有些降解，而RNARNA的降解是从的降解是从55端开始的，所以用端开始的，所以用55末端磷酸化的末端磷酸化的RT-primerRT-primer去拉的时候，去拉的时候，55末端往往不全，而且随着末端往往不全，而且随着RNARNA链的链的增长，比如几增长，比如几KbKb以上的，就更不能保证该引物能将以上的，就更不能保证该引物能将55末端拉全。末端拉全。45Takara公司的公司的5RACE新方法新方法46对5race做一点说明v这

23、个方法其实存在着很大的局限。这个方法其实存在着很大的局限。v因为我们平时提因为我们平时提RNARNA时，一般多少都有些降解，而时，一般多少都有些降解，而RNARNA的降解的降解是从是从55端开始的，所以你用端开始的，所以你用5 5末端磷酸化的末端磷酸化的RTprimerRTprimer去拉的去拉的时候，时候，5 5末端往往不全，而且随着末端往往不全，而且随着RNARNA链的增长，比如几链的增长，比如几KbKb以以上的，就更不能保证该上的，就更不能保证该primeprime能将能将5 5末端拉全。末端拉全。478 8、SMARTSMART技术技术全长全长cDNAcDNA文库的构建技术文库的构建技

24、术Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript(SMART)前提： 真核细胞的真核细胞的mRNAmRNA在加工过程中有一个比喻为在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽穿鞋戴帽”的过程：的过程：1 1、mRNAmRNA的的33末端都带有一段末端都带有一段Poly APoly A（利用逆转录（利用逆转录酶制备酶制备cDNAcDNA文库的基础）文库的基础）2 2、 mRNAmRNA的的55末端是真核末端是真核mRNAmRNA特有的特有的“帽子结构帽子结构”，即甲基化的即甲基化的G G。48SMARTSMART技术的原理技术的原理v在合成在合成cDN

25、AcDNA的反应体系中，事先加入一条的反应体系中，事先加入一条33末端带末端带OligoOligo（dGdG）的）的SMARTSMART引物引物；v在逆转录酶以在逆转录酶以mRNAmRNA为模板合成为模板合成cDNAcDNA第一链阶段，序列延第一链阶段，序列延伸到伸到mRNAmRNA的的55末端时碰到真核末端时碰到真核mRNAmRNA特有的特有的“帽子结帽子结构构”，即甲基化的，即甲基化的G G时会连续在合成的第一链时会连续在合成的第一链cDNAcDNA末端末端加上几个（加上几个（dCdC），），vSMARTSMART引物的引物的OligoOligo（dGdG）与合成）与合成cDNAcDNA末

26、端突出的几个末端突出的几个C C配对后形成配对后形成cDNAcDNA的延伸模板（此时，含有的延伸模板（此时，含有OligoOligo（dGdG）的的SMARTSMART引物成为模板）引物成为模板）49v逆转录酶会自动转换模板，以逆转录酶会自动转换模板，以SMARTSMART引物作为延伸模板继续引物作为延伸模板继续延伸延伸cDNAcDNA单链直到引物的末端，单链直到引物的末端，v这样得到的所有这样得到的所有cDNAcDNA单链的一端有含单链的一端有含OligoOligo（dTdT）的起始引）的起始引物序列，另一端有已知的物序列，另一端有已知的SMARTSMART引物序列，合成第二链后可引物序列，

27、合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。以利用通用引物进行扩增。v由于有由于有55帽子结构的帽子结构的mRNAmRNA才能利用这个反应得到能扩增的才能利用这个反应得到能扩增的cDNAcDNA，因此扩增得到的，因此扩增得到的cDNAcDNA就是全长就是全长cDNAcDNA。50SMARTSMART技术的特点技术的特点v主要用途：直接扩增基因、主要用途：直接扩增基因、 构建构建cDNAcDNA文库、文库、 已知序列钓全长已知序列钓全长cDNAcDNA（RACERACE） 用于芯片检测的用于芯片检测的cDNAcDNA探针的扩增等。探针的扩增等。 v利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，利用逆转录酶内源的末

28、端转移酶活性，v单管内一步完成，无需额外的单管内一步完成，无需额外的cDNAcDNA抽提纯化或沉淀，或者额抽提纯化或沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至外的酶反应，只需要少至25ng25ng的的mRNAmRNA或者或者50ng50ng的的Total RNATotal RNA就可以得到高质量、高产量的就可以得到高质量、高产量的cDNAcDNA库，得到的库，得到的cDNAcDNA能够代表能够代表原有样品中的原有样品中的mRNAmRNA的丰度的丰度519 9、不对称、不对称PCRPCRv在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，v前10-12个循环两条模板等量扩增，之后低

29、浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）v用于直接测序用于直接测序5210、实时荧光定量、实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR）v普通普通PCRPCR技术的定性和定量分析：技术的定性和定量分析： 定性：凝胶电泳的方法定性：凝胶电泳的方法 定量：通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描进行分析定量：通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描进行分析 对象：对象：PCRPCR扩增的终产物扩增的终产物v普通普通PCRPCR技术的局限性：无法获得技术的局限性：无法获得某一转基因动、某

30、一转基因动、植物转基因的植物转基因的拷贝数拷贝数 或者或者 某一特定基因某一特定基因在特定在特定组织中的表达量组织中的表达量53Real-time Q-PCRReal-time Q-PCRv简言之，利用荧光信号检测整个简言之，利用荧光信号检测整个PCRPCR扩增过程，获扩增过程，获得在线描述得在线描述PCRPCR过程的动力学曲线过程的动力学曲线v特点：可以对特点：可以对DNADNA模板进行定量分析模板进行定量分析 具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、 能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、 具实时性和准确性等特点。具实时

31、性和准确性等特点。v实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术 是一种在是一种在PCRPCR反应体系中加入荧光基反应体系中加入荧光基团团, ,利用荧光信号积累实时监测整个利用荧光信号积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。曲线对未知模板进行定量分析的方法。54两个重要概念两个重要概念(1)(1)荧光域值（荧光域值（threshold,threshold,开端？）开端？） 以以PCRPCR反应的前反应的前1515 个个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-153-15个循

32、环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010 倍。倍。(2)Ct(2)Ct值值( (循环阈值循环阈值) )：C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold。指在。指在PCRPCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。点所对应的循环次数。Real-time Q-PCR在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻的域值的时刻, ,可见可见CtCt值取决于阈值。值取决于阈值。 55荧光

33、定量PCR相同模板在同一台相同模板在同一台PCRPCR仪上进行仪上进行9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图 （终点处检测产物量不恒定；（终点处检测产物量不恒定；CtCt值则极具重现性值则极具重现性) ) CtCt值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR反应早期：反应早期：PCR产物产生荧产物产生荧光的水平不能与光的水平不能与背景明显地区别背景明显地区别从从Ct开始，荧光的产生进开始，荧光的产生进入入指数期指数期、线性期线性期和最终和最终的的平台期平台期56CtCt值与模板的起始拷贝数的关系值与

34、模板的起始拷贝数的关系经数学证明：经数学证明：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值与模板DNA的起始拷贝数（dRn）成反比：起始拷贝数越多，Ct值越小 。57v标准曲线：标准曲线： CtCt与起始模板量的对数呈与起始模板量的对数呈关系。关系。 PCRPCR扩增过程中引入一系列起始浓度的模板与未扩增过程中引入一系列起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的知样品同时进行扩增，利用该系列模板的CtCt值与值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算未知样品的起始模板浓度。算未知样品的起始模板浓度。 58荧光定量标准

35、曲线荧光定量标准曲线 59实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的应用技术的应用mRNAmRNA表达的研究表达的研究DNADNA拷贝数的检测拷贝数的检测单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPsSNPs）的测定）的测定病原体的检测病原体的检测肿瘤诊断肿瘤诊断基因突变、多态性及表达的研究基因突变、多态性及表达的研究遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断60存在的问题及应用前景存在的问题及应用前景v在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同

36、，致使实验结果缺乏可比性。的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。v用用real-time Q-PCRreal-time Q-PCR来研究来研究mRNAmRNA时，受到不同时，受到不同RNARNA样本存在样本存在不同的逆转录（不同的逆转录（RTRT）效率的限制。）效率的限制。 在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。物也是实验结果可靠与否的关键。61Real-time Q-PCR的不足之处的不足之处（与传统

37、的PCR技术相比）v1 1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；因此也就不能监测扩增产物的大小；v2 2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了制了real-time Q-PCRreal-time Q-PCR的复合式（的复合式（multiplexmultiplex）检测的应用能）检测的应用能力；力；v3 3）目前）目前real-time Q-PCRreal-time Q-PCR实验成本比较高，从而也限制了其实验成本比较高，从而也限制了

38、其广泛的应用。广泛的应用。62RT-Q PCR 存在的问题存在的问题v在标准曲线定量中，各实验室需要一个统一的标准品；在标准曲线定量中，各实验室需要一个统一的标准品；v实验成本较高，荧光素种类以及检测光源的局限性，限制了实验成本较高，荧光素种类以及检测光源的局限性，限制了它的应用能力；它的应用能力；v研究研究mRNAmRNA时，受到不同时，受到不同RNARNA样本存在不同的逆转录（样本存在不同的逆转录（RTRT）效）效率的限制；率的限制；v相对定量的前提：假设内源控制物不受实验条件的影响，内相对定量的前提：假设内源控制物不受实验条件的影响，内源控制物的选择也是实验结果可靠与否的关键；源控制物的

39、选择也是实验结果可靠与否的关键；v不能监测扩增产物的大小（运用封闭检测技术）；不能监测扩增产物的大小（运用封闭检测技术）；63DNA序列测定序列测定64DNA测序技术的诞生和发展测序技术的诞生和发展v1980年， Sanger和Gilbert 因建立DNA测序技术而获得诺贝尔化学奖（Sanger是第2次获得诺贝尔化学奖 ）v1977年，美国哈佛大学生化学家Walter Gilbert发明DNA化学降解法测序技术(Maxam 和Gilbert,1977)v1977年，英国剑桥医学研究会的分子生物学实验室Frederick Sanger 发明双脱氧链终止法DNA测序技术(Sanger和Coulso

40、n)，迄今为止DNA测序技术的诞生（第一代测序技术的诞生（第一代DNA测序技术）测序技术）65vSangerSanger法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了迄今为止迄今为止DNADNA测序的主流。测序的主流。v第二代测序技术（第二代测序技术（Next-generation sequencing)Next-generation sequencing)：费：费用更低、通量更高、速度更快用更低、通量更高、速度更快。66第二代第二代DNA测序技术测序技术v现有的技术平台主要包括：现有的技术平台主要包括：Roche/454 FLX、Illumina/Sol

41、exa Genome Analyzer 和和 Applied Biosystems SOLID system。v三个技术平台各自的优点：三个技术平台各自的优点：v454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到）能达到400bp；vSolexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的测序的1/10；vSOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在，而在15X覆盖率时的准确度可以达到覆盖率时的准确度可以达到99.999%，目，目前第二代测序技术中准确度最高。前第二代测序技术中准确度最高。v核心思想：边合成边测序（核心思想：边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。的序列。v例如，例如，Illumina/Solexa Genome AnalyzerIllu