早期给予红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡的影响

1、早期给予红花注射液对大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡的影响马全瑞，孙金萍，张莲香，李玲，张海雨，文玉军，秦毅【摘要】目的讨论大鼠实验性脑出血后早期不同时间注射红花注射液后，对血肿周围细胞凋亡及细胞凋亡相关蛋白等指标的影响。方法将96只SD大鼠随机分成红花治疗组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治疗组。各组均于脑出血后第72h处死，取脑，连续切片做TUNEL染色和免疫组化染色。观察不同时间用药对大鼠神经功能评分、血肿周围细胞凋亡数目及凋亡相关蛋白aspase-3和Bl-2/Bax等指标的影响。结果与出血对照组相比拟，各药物治疗组的神经功能评分降低、Bl-2

2、/Bax蛋白比值增高、aspase-3蛋白阳性细胞数减少、TUNEL阳性细胞数减少；红花注射液组在脑出血前24h和脑出血后0h给药治疗的Bl-2/Bax蛋白比值低于脑出血后6、12、24h治疗组、aspase-3蛋白阳性细胞数高于脑出血后6、12、24h治疗组；在大鼠脑出血后6h、12h、24h注射红花注射液，出血灶周围aspase-3阳性细胞逐渐增多、Bl-2/Bax比值逐渐降低，出血后6h给药治疗组的TUNEL阳性细胞数低于出血后24h治疗组。结论在不同时间给予红花注射液治疗脑出血大鼠，均能不同程度地促进脑出血大鼠神经功能的恢复，其中术后6h给药组治疗效果最好，其可能通过促进Bl-2蛋白的

3、表达，抑制Bax和aspase-3蛋白的表达，从而抑制血肿周围的细胞凋亡。【关键词】脑出血；细胞凋亡；红花注射液；大鼠TheeffetfSafflrinjetinnellapptsisarundtheheataintheearlytieafterexperientalintraerebralherrhageinrats【Abstrat】bjetiveTstudytheeffetfSafflrinjetinnappttiellandprtEinabutappttiellintheearlytieafterexperientalintraerebralherrhageIHinrats.ethds9

4、6ratsererandlydividedintthereedialgrupithIHandthentrastgrupinludingIHntrastgrupithIHandnralntrastgrupithutIH.Theneahgrupfratseredividedintfivegrupshihere24hursreedialgrupbefreIHfrats,0,6,12and24hursreedialgrupafterIHfrats.Allratsinvlvedintheexperienterekillednthe72ndhurfllingIH.Theiunhistheialethdas

5、perfredinratbrainbyusingantibdyaspase-3rantibdybl-2,bax.TUNELethdasusedtdetetapptsisarundtheheata.ResultsparedithIHdelgrup,Safflrinjetinuldsignifiantlyalleviateneurlgialsystedaagesypts,heightentheratifbl-2/bax,andreduethenuberfaspase-3psitiveellandthenuberfTUNELpsitiveellarundheatainIHrats.Thenuberf

6、aspase-3psitiveellfSafflrgruptreatedbefreIH24hursahead,afterIH0hurererethanthatfSafflrgruptreatedafterIH6,12,24hurs.Thebl-2/baxfSafflrgruptreatedbefreIH24hursahead,afterIH0hurerelerthanthatfSafflrgruptreatedafterIH6,12r24hurs.henthetreatedgrupereinjetedSafflrafterIH6,12,24hurs,Thenuberfaspase-3psiti

7、veellarundheataasgraduallyinreasedandthenuberfbl-2/baxpsitiveellasgraduallydegradedandthenuberfTUNELpsitiveellfSafflrgruptreatedafterIH6hurserelessthanthatfSafflrgruptreatedafterIH24hurs.nlusinshenSafflrinjetinisusedearliertureIH,itandereasetheratefellapptsisandapase-3prteinexpressin,heightentherati

8、fbl-2/baxarundtheheata,espeiallyintheSafflrgruptreatedafterIH6hurs.【Keyrds】intraerebralherrhage;apptsis;Safflrinjetin;rat脑出血是一种发病率、病死率和致残率均较高的临床常见病和多发病，迄今为止对脑出血的治疗虽较以往有很大进步，但脑出血仍具有相当高的死亡率。近年来，局部作者应用活血化瘀法治疗急性期脑出血获得了一定的疗效，但在治疗的时机上，特别在早期使用活血化瘀药治疗脑出血患者尚存在较大的争议。1材料与方法1.1材料1.1.1动物SD大鼠雌雄不限126只，体重230280g，由宁

9、夏医学院实验动物中心提供，动物合格证号SXK宁20220001。1.1.2主要试剂红花注射液雅安三九药业，批号070304，型胶原酶siga公司，TUNEL检测试剂盒Rhe公司，aspase-3多克隆抗体武汉博士德公司，Bl-2、Bax单克隆抗体Sataruz公司，DAB染色试剂盒北京中衫生物公司。1.2方法1.2.1动物分组将大鼠雌雄对半随机分成红花治疗组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治疗组，各红花治疗组每日腹腔注射红花注射液1次，剂量为1.5l/kgd，正常对照组和出血对照组组每日腹腔注射等量生理盐水1次。每日进展神经功能评分1次，各组大鼠均

10、于脑出血后第72h处死。1.2.2脑出血大鼠模型制作根据脑立体定位图谱于大鼠前囟后0.2，中线右侧旁开3.0钻孔，暴露硬脑膜。微量进样器汲取0.5u/l型胶原酶和6.25u/l肝素的混合液0.26l，以硬脑膜平面为零点，缓慢进针，深度为5.0，缓慢注入药物，注射完毕后留针10in，缓慢退出微量进样器，清洁伤口，缝合头皮，术后保温。1.2.3免疫组织化学染色石蜡切片，采用SP法，DAB显色，光学显微镜下观察。于200倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在2、4、6、8、10、12六个时钟点中选择5个不重复视野区，计数阳性细胞数，计算平均值。1.2.4细胞凋亡的检测取与免疫组化染色相邻切片,用末端脱氧核

11、糖核苷转移酶介导的DUTP缺口末端标记法TUNEL，DAB显色。于200倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在2、4、6、8、10、12六个时钟点中选择5个不重复视野区，计数TUNEL反响阳性细胞数，计算平均值。1.2.5统计学处理结果用xs表示。统计学处理采用SPSS11.5软件包进展t检验、方差分析,显著性水准均为=0.05。2结果2.1大鼠神经功能缺损评分麻醉清醒后，模型组动物均出现不同程度神经功能缺损表现，根据Berdersn评分标准对术后各组大鼠进展神经功能评分，各组评分情况见表1。表1脑出血后各时相点神经功能评分注：ntes:P0.01，VSIHgrup2.2免疫组化aspase-3蛋白

12、表达以细胞浆或细胞核中呈棕黄色着色的颗粒为阳性细胞，Bl-2和Bax蛋白表达均以细胞浆呈棕黄色着色为阳性细胞，以神经元细胞表达为主，并且主要集中在血肿周围脑组织。正常对照组也可见到较少的aspase-3蛋白、Bl-2蛋白和Bax蛋白阳性细胞表达，但Bl-2/Bax的比值始终接近1。2.3TUNEL染色根据免疫组化的结果，选取差异显著的两个时间点进一步做TUNEL染色，TUNEL阳性细胞以细胞膜周边染色质堆积染色呈棕黄色或细胞核着色呈棕黄色评判为TUNEL阳性细胞。在血肿周边的外围，以神经元为主，少局部是神经胶质细胞和血管内皮细胞。IH各组、各时间点凋亡细胞表达情况见表2、表3。表2各药物在不同

13、时间点给药时血肿周围aspase-3、Bl-2、Bax阳性细胞记数注:VSIHgrup，P0.01,VS24hursaheadreedialgrup,P0.01,VS24hursaheadreedialgrup,P0.05,VS0hursreedialgrup，P0.01,VS0hursreedialgrup,P0.05表3各组在术后6、24h给药时血肿周围TUNEL阳性细胞数注：P0.01，VSIHgrup3讨论脑出血是一种严重危害人类生命安康的临床常见病和多发玻据统计，在我国脑出血占急性脑血管病脑卒中的40%50%，是脑卒中死亡率最高的临床类型，脑出血后30天内病死率接近50%，许多存活者

14、遗留明显的神经功能缺失。在治疗上目前临床上除运用传统脱水药、手术去除血肿外，治疗手段较少，无其他特效的方法1，且相当局部脑出血患者虽早期行血肿去除，但预后仍然不佳。千百年来中医中药在脑卒中的治疗得以广泛的应用，局部作者应用活血化瘀法治疗急性期脑出血获得了一定的疗效，但在治疗的时机上特别在早期使用活血化瘀药治疗脑出血患者尚存在较大的争议。文献说明，细胞凋亡是脑出血后细胞死亡主要途径之一2。各种动物实验说明，脑出血后46h细胞凋亡即开场出现，凋亡顶峰在脑出血后4872h3。另外，有研究说明：脑细胞缺血后先出现促凋亡基因表达，后出现神经元群体的凋亡，这就为治疗提供了时间窗，从理论上推测假如能在发病早

15、期抑制促凋亡基因的表达或促进抑制凋亡基因的表达，就能有效地保护神经元细胞的损伤。目前认为，哺乳动物的细胞凋亡至少由两条通路构成，即死亡受体通路和线粒体通路，这两条凋亡途径不是孤立的,后期的共同途径是aspases的激活，其中aspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，在细胞凋亡分子机制网络中居核心地位4。线粒体在多种凋亡途径中起到了核心作用5，在线粒体通路调节细胞凋亡中，Bl-2基因家族是目前较为公认与之亲密相关的基因。Bl-2和Bax是Bl-2基因家族中已被发现的与细胞凋亡关系亲密的两种基因，是一对在功能上互相对立的细胞凋亡调控基因，在中枢神经系统中均有表达。Bl-2和Bax是两类典型的抑

16、凋亡和促凋亡蛋白，Bl-2与bax结合成异二聚体是Bl-2发挥抗凋亡活性所必需的6，Bl-2/Bax异二聚体，可通过阻断细胞色素的释放，抑制下游aspase-3的激活，从而抑制凋亡的发生，即细胞内Bl-2与Bax比例决定受凋亡信号刺激细胞的最终命运，Bl-2/Bax值增加，细胞凋亡减少；反之，那么诱发细胞凋亡机制的启动7。脑出血后脑内血肿，中医认为离经之血即为淤血，治法也应活血化瘀。祖国医学认为血瘀是中风的本质，活血化瘀是治疗中风的根本大法，但在治疗时机上存在较大争议。有作者认为活血化瘀不管在早期先驱病症、发作期，还是恢复期均可应用。特别提出，在急性脑血管疾病中，控制出血不是采取止血方法，而是

17、应用活血止血、化瘀止血、理气止血等法。红花作为一种应用普遍的强活血药，临床广泛应用于脑中风的治疗。现代药理研究显示红花具有:扩张血管、降低血压8；抑制血小板活化因子诱发血小板聚集、释放及血小板内游离钙浓度升高；抑制诱发的人中性粒细胞聚集、粘附9,10，进步大鼠的纤溶性11；抑制缺血脑线粒体膜流动性的降低、线粒体肿胀、脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和降低细胞色素氧化酶活性；抑制a2+过多摄入，改善线粒体呼吸功能，拮抗氧自由基12。众多的医家使用活血化瘀药多在脑出血的亚急性期3天或3天以后。况时祥13认为活血化瘀药在脑出血急性期的主要作用还在于改善由出血而引发的血液循环障碍，减轻脑组织的缺血缺氧损伤，而并非

18、消除血肿或减轻脑水肿，反对一味寻求促进血肿去除的峻猛之药,并指出脑出血在使用活血化瘀保持慎重态度，防止再出血，认为发病后624h内应为应用活血化瘀类药的最正确时机。本实验的研究结果显示：1实验性IH后不同时间点使用红花注射液治疗均有效果。26h治疗组和12h治疗组治疗效果优于其他组。从行为学表现来看，从术后6h开场对大鼠进展神经功能评分，各治疗组神经功能缺失病症明显轻于出血对照组，但各治疗组组间比拟无差异。从凋亡相关蛋白表达情况来看，各治疗组均能减少脑出血后的出血灶周围凋亡蛋白aspase-3的表达，升高Bl-2/Bax的比值，与出血对照组相比拟差异有显著性P0.01，且出血灶周围aspase

19、-3、Bax蛋白的表达情况与TUNEL染色结果相一致。正常对照组组的Bl-2/Bax的比值接近于1。对本实验不同时间用药的结果进展分析说明，在大鼠脑出血后6h以前给红花注射液治疗，与大鼠脑出血后6h以后给红花注射液治疗相比拟出血灶周围aspase-3阳性细胞明显增加、Bl-2/Bax比值明显降低，提示红花注射液在脑出血后6h以前用药效果不理想，可能与红花注射液在出血同时给药时抑制血小板聚集9，加重脑出血有关。从TUNEL阳性表达情况来看，红花术后6h治疗组和红花术后24h治疗组凋亡率低于出血对照组，并且红花术后6h治疗组较红花术后24h治疗组血肿周围TUNEL阳性细胞数有所减少，但差异无显著性

20、P0.05。在大鼠脑出血后6、12、24h注射红花注射液，出血灶周围aspase-3阳性细胞逐渐增多、Bl-2/Bax比值逐渐降低，与TUNEL染色结果相一致，提示红花注射液在大鼠脑出血6h以后尽早用药效果比拟理想，与文献14报道一致。推测其可能与通过促进Bl-2蛋白的表达，抑制Bax和aspase-3蛋白的表达，从而降低血肿周围凋亡细胞的表达有关。另外在本实验中，在大鼠脑出血后0h给予红花注射液治疗，有1例血肿周边见可到新颖出血灶，说明出血6h以内应慎用活血化瘀药物来治疗脑出血。但在脑出血后康复治疗阶段应用红花注射液治疗脑出血的效果如何有待进一步的研究。综上所述，红花注射液早期治疗实验性大鼠

21、脑出血可明显减少血肿周围的细胞凋亡率，脑出血6h以内应慎用活血化瘀药物来治疗脑出血，脑出血6h以后尽早用药效果较理想。【参考文献】1HekannJG,ErbguthFJ,HilzJ,etal.erebrvasularirulatinfralinialvie.Histrialrevie,physilgy,pathphysilgy,diagnstiandtherapeutiaspets.deKlinunih,2001,9610:583-592.2Khjiatsushita,Eieng,Xiaringng,etal.Evidenefrapptsisafterintraerebralherrhageinratstriatu.erebBldFletab,2000,202;396-404.3NakashiaK,YaashitaK,UesugeS,etal.Tepralandspatialprfilefappttielldeathintransientintraerebralasslesinftherat.Neurtraua,1999,16;143-151.4金伯泉.细胞和分子免疫学,第2版.北京：科学出版社,2001，202-208.5GreenDR,KreerG.Thepathphysilgyfithndrialelldeat