核酸测序技术分析解析

1、核酸测序技术分析解析核酸测序技术分析解析第1页序列测定技术 经典方法:第一代：Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)第二代：循环阵列合成测序法第三代：直接测序核酸测序技术分析解析第2页与 PCR反应类似。反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物；反应过程： 变性复性延伸终止第一代：Sanger双脱氧终止法核酸测序技术分析解析第3页Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）ddNTPs 是反应终止剂 因为ddNTP2和3都不含羟基，在DNA合成反应

2、中不能形成磷酸二酯键，所以能够被用来中止DNA合成反应。它能够看成正常碱基参加复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs浓度远高于ddNTPs(普通34 ：1)。核酸测序技术分析解析第4页*少一个OH脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较H核酸测序技术分析解析第5页核酸测序技术分析解析第6页Sanger第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快核酸测序技术分析解析第7页ddNTPs参加下DNA复制Sanger法测序产物平均链长取决于ddNTP与dNTP百分比，百分比高时，得到较短产物； 核酸测序技术分析解析第8页Gel Electrophoresis DNA Frag

3、ment Size DeterminationDNA 带负电DNA在电泳胶中迁移率与其片段大小相关Sanger第二步：荧光检测核酸测序技术分析解析第9页除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。核酸测序技术分析解析第10页核酸测序技术分析解析第11页PCR-Polymerase Chain Reaction 多聚酶链式反应通常DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目标基因载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关过程,操作复杂,普通需要数周时间。核酸测序技术分析解析第12页目标基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取

4、DNA分子核酸测序技术分析解析第13页DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger测序技术引物DNA聚合酶1977年核酸测序技术分析解析第14页加热变 性复性复温DNA变性和复性加热或强酸、碱性作用能够使 DNA双螺旋氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA变性。解除变性条件后, 变性单链能够重新结合起来,形成双链,其原有特征和活性能够恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 核酸测序技术分析解析第15页PCR扩增原理引物延伸延伸5533变性、退火变性、退火核酸测序技术分析解析第16页PCR技术创建Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性

5、,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA构想。 1983年,Mullis创造了PCR技术,使Khorana构想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学创造之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。核酸测序技术分析解析第17页Adlemans solution of the Hamiltonian Directed Path Problem(HDPP).I believe things like DNA computing will eventually

6、 lead the way to a “molecular revolution,” which ultimately will have a very dramatic effect on the world. L. Adleman核酸测序技术分析解析第18页19The ProblemA directed Graph G=(V,E)|V|=n, |E|=m and two distinguished vertices Vin = s and Vout= t.Verify whether there is a path (s,v1,v2,.,t)which is a sequence of “

7、one-way” edges that begins in Vin and Voutwhose length (in no.of edges) is n-1 and (i.e. enters all vertices.)Whose vertices are all distinct (i.e. enters every vertex exactly once.)A CLASSIC NP-COMPLETE PROBLEM核酸测序技术分析解析第19页20Examples45362tA directed Graph. An st hamiltonian path is (s,2,4,6,3,5,t)

8、.Here Vin=s and Vout=t.What happens if some edge ex:24 is removed from the graph?What happens if the designated vertices are changed to Vin = 2 and Vout =4?核酸测序技术分析解析第20页21Why not brute force algorithm?Brute force algorithm is to Generate all possible paths with exactly n-1 edgesVerify whether one o

9、f them obeys the problem constraints.Problem: How many paths can there be? such paths could be (n-2)!So, what did Dr. Adleman use? Generate and test strategy where number of random paths were generated and tested.核酸测序技术分析解析第21页22Adlemans Experimentmakes use of the DNA molecules to solve HDPP.good th

10、ing about random path generation-each path can be generated independent of all others bringing into picture- “Parallelism” . On the other hand adding “Probability” too.No. of Lab procedures grows linearly with the no. of vertices in the graph.Linear no. of lab procedures is due to the fact that an e

11、xponential no. of operations is done in parallel.At the heart, it is a brute force algorithm executing an exponential number of operations.核酸测序技术分析解析第22页23 Algorithm(non-deterministic)1.Generate Random paths2.From all paths created in step 1, keep only those that start at s and end at t.3.From all r

12、emaining paths, keep only those that visit exactly n vertices.4.From all remaining paths, keep only those that visit each vertex at least once.5.if any path remains, return “yes”; otherwise, return “no”.核酸测序技术分析解析第23页24 Step 1.Random Path Generation.AssumptionsRandom single stranded DNA sequences wi

13、th 20 nucleotides are available.Generation of astronomical number of copies of short DNA strands is easy to do.Vertex representationEach vertex v in the graph is associated with a random 20-mer sequence of DNA denoted by Sv. For each such sequence obtain its complement Sv.Generate many copies of eac

14、h Sv sequence in test tube T1.核酸测序技术分析解析第24页25 For example, the sequences chosen to represent vertices 2,4 and 5 are the following:S2 = GTCACACTTCGGACTGACCTS4 = TGTGCTATGGGAACTCAGCGS5 = CACGTAAGACGGAGGAAAAAThe reverse complement of these sequences are:S2 = AGGTCAGTCCGAAGTGTGACS4 = CGCTGAGTTCCCATAGCA

15、CAS5 = TTTTTCCTCCGTCTTACGTG5 20 mer 3核酸测序技术分析解析第25页26Step1. Random Path Generation.Edge representationFor each edge uv in the graph, the oligonucleotide Suv is created that is 3 10-mer of Su followed by 5 10-mer of SvIf u=s then it is all of Su or if v=t then it is all of Sv.(i.e.each edge denoted b

16、y 20-mer while the edge that involves either s or t is a 30-mer.)With this construction, Suv = Svu. (Preservation of Edge Orientation.)Generate many copies of each Suv sequence in test tube T2核酸测序技术分析解析第26页275 S2 35 S4 3 Edge(2,4) 5 S5 35 S4 3 Edge(4,5) 核酸测序技术分析解析第27页28S2 = GTCACACTTCGGACTGACCTS4 =

17、TGTGCTATGGGAACTCAGCGS5 = CACGTAAGACGGAGGAAAAAS2 = AGGTCAGTCCGAAGTGTGACS4 = CGCTGAGTTCCCATAGCACAS5 = TTTTTCCTCCGTCTTACGTGSo,we build edges (2,4) and (4,5) from the above sequences obtaining them in the following manner:(2,4) = GGACTGACCTTGTGCTATGG (4,5) = GAACTCAGCGCACGTAAGAC核酸测序技术分析解析第28页29Step1.Ran

18、dom Path GenerationPath ConstructionPour T1 and T2 into T3.In T3 many ligase reactions will take place.(Ligase Reaction or ligation: There is an enzyme called Ligase, that causes concatenation of two sequences in a unique strand.)核酸测序技术分析解析第29页30By executing these 3 operations,we get many random pat

19、hs for the following reasons:Consider Su,Sv,Sw,Suv,Svw for u,v,w distinct vertices.10 base suffix of one Su sequence will bind to the 10 base prefix of one Suv sequence. (one is complement of the other.)At the same time 10-base suffix of same sequence Suv binds to the 10-base prefix of one Sv sequen

20、ceSv 10-base suffix binds to the 10-base prefix of one Svw sequence.The final double strand thus obtained encodes (u,v,w) in G.Step1.Random Path Generation核酸测序技术分析解析第30页31Examples of random paths formedS2S4S6sS2S3E24E46E62E2sEs3S6tS5S3E5tE35E63sS2Es2核酸测序技术分析解析第31页32Formation of Paths from Edges and

21、compliments of verticesEdge uvEdge vwSuSwSv核酸测序技术分析解析第32页33 Finally the path (2,4,5) will be encoded by the following double strand.5(2,4)GTCACACTTCGGACTGACCTTGTGCTATGGCAGTGTGAAGCCTGACTGGAACACGATACCCTTGAGTCGC S2 S4 (4,5) 3.GAACTCAGCGCACGTAAGACGGAGGAAAAA .GTGCATTCTGCCTCCTTTTTS5 核酸测序技术分析解析第33页34Step 2

22、“keep only those that start at s and end at t.” Product of step 1 was amplified by PCR using primers Ss and St.By this, only those molecules encoding paths that begin with vertex s and end with vertex t were amplified.核酸测序技术分析解析第34页35 Step 3 “keep only those that visit exactly n vertices”Product of

23、step 2 is run on agarose gel and the 140bp (since 7 vertices) band was excised and soaked in doubly distilled H2O to extract DNA.This product is PCR amplified and gel purified several times to enhance its purity.核酸测序技术分析解析第35页36Step 3 “keep only those that visit exactly n vertices”DNA is negatively

24、charged.Place DNA in a gel matrix at the negative end. (Gel Electrophoresis)Longer strands will not go as far as the shorter strands.In our example we want DNA that is 7 vertice times 20 base pairs, or 140 base pairs long.核酸测序技术分析解析第36页37Step 4 “keep only those that visit each vertex at least once”F

25、rom the double stranded DNA product of step3, generate single stranded DNA.Incubate the single stranded DNA with S2 conjugated to the magnetic beads.Only single stranded DNA molecules that contained the sequence S2 annealed to the bound S2 and were retainedProcess is repeated successively with S4,S6

26、,S3,S5核酸测序技术分析解析第37页38Step 4 “keep only those that visit each vertex at least once”Filter the DNA searching for one vertex at a time.Do this by using a technique called Affinity Purification. (think magnetic beads)s2t46355complimentMagnetic bead核酸测序技术分析解析第38页39Step 5:Obtaining the AnswerConduct a “g

27、raduated PCR” using a series of PCR amplifications.Use primers for the start, s and the nth item in the path.So to find where vertex 4 lies in the path you would conduct a PCR using the primers from vertex s and vertex 4.You would get a length of 60 base pairs.60 / 20 nucleotides in the path = 3rd v

28、ertex.核酸测序技术分析解析第39页1.2代80年代中期出现了以荧光标识代替放射性同位素标识、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影自动测序仪。另外，90年代中期出现毛细管电泳技术使得测序通量大为提升。核酸测序技术分析解析第40页鸟枪测序法(shotgun sequencing)：随机克隆测序 将待测DNA片段随机打断并构建随机重合克隆文库，然后经过通用引物测定每个克隆中待测DNA序列。当这些已测序列数量到达一定程度后，相当于待测DNA片断每一部位序列也就被测定出来了，经过这些所测序列之间重合个别，最终可将整个DNA片断序列拼接出来，这么测序策略称为随机克隆测序。 核酸测序技

29、术分析解析第41页鸟枪法测序缺点伴随所测基因组总量增大，所需测序片段大量增加，造成重复测定，也易丢失一些序列，且数据处理分析工作量大。高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，造成判断失误。核酸测序技术分析解析第42页完整基因组测序过程普通包含三个步骤：（1）建立克隆物理图谱：如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等；（2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆序列；（3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，能够利用序列分析工具

30、，进行序列拼接；继而经过与数据库序列比较，得到与该序列相关信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列生物学特征进行注释。 基因组测序核酸测序技术分析解析第43页DNA全序列切成小段小段和载体结合结合后进行测序核酸测序技术分析解析第44页Map fragmentsSequence overlappingfragmentsAssembledsequence基因组DNA序列测定示意图 经过随机剪切得到大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重合片段图谱，并对重合片段进行测序，经过“拼装”得到基因组序列。另一个方法不是依据片段染色体位置，而是依据其重合个别进行“拼装”。Sequence all f

31、ragments and assemble核酸测序技术分析解析第45页第一代测序优缺点经过几十年逐步改进, 第1 代测序仪读长能够超出1000 bp, 原始数据准确率能够高达99.999%,测定每千碱基序列成本是0.5 美元, 天天数据通量能够到达600000 碱基. 不论这些数字怎样令人印象深刻, 第1 代测序技术在速度和成本方面都已到达了极限. 因为其对电泳分离技术依赖, 使其难以深入提升分析速度和提升并行化程度, 而且难以经过微型化降低测序成本. 所以, 需要开发全新技术来突破这些局限.尽管如此, 第1 代技术是不会很快消失, 它将与新若干代测序平台并存. 这些久经考验方法可靠、准确,

32、且已形成规模化, 尤其是在PCR 产物测序、质粒和细菌人工染色体末端测序、以及STR基因分型方面, 将继续发挥主要作用.核酸测序技术分析解析第46页第2代测序技术循环阵列合成测序法核酸测序技术分析解析第47页第二代测序Roche企业454技术Illumina企业Solexa技术ABI企业SOLiD技术第二代测序技术不但保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提升了测序速度使用第一代Sanger测序技术完成人类基因组计划，花费了30亿美元巨款，用了三年时间；然而，使用第二代SOLiD测序技术，完成一个人基因组测序现在只需要一周左右时间。核酸测序技术分析解析第48页Roche企业454测序技

33、术Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors Margulies, M. Eghold, M. et al. Nature. Sep 15; 437(7057):326-7核酸测序技术分析解析第49页454 流程1、文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链DNA 。核酸测序技术分析解析第50页454 流程2、Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕捉磁珠上，乳化，形成油包水混合物，每个独特片断在自己微反应器里进

34、行独立扩增，回收纯化； 核酸测序技术分析解析第51页454 流程3、测序反应：携带DNA片段磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。 核酸测序技术分析解析第52页454 流程测序反应采取焦磷酸测序法，将一个含有比PTP板上小孔直径更小磁珠放入小孔，开启测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增ssDNA为模板，每次反应加入一个dNTP进行合成反应。假如这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放焦磷酸基团会与反应体系中ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中荧光素分子并发出荧光。测序反应产生荧光信号由放置在PTP板另一侧CCD摄影机统计，再经过计算机分析转换为

35、测序结果。因为每种dNTP在反应中产生荧光颜色不一样，所以能够依据荧光颜色来确定被测分子序列核酸测序技术分析解析第53页454 流程4、数据分析：GS FLX系统在10小时运行当中可取得100余万个读长，读取超出4-6亿个碱基信息 核酸测序技术分析解析第54页454特点读长较长，400bp以上在测定同核苷酸聚合物区域时, 如一连串GGGGGG, 焦磷酸测序会碰到问题, 不得不依靠光信号强度来推断同聚核苷酸长度, 这就轻易产生错误. 所以, 这一技术平台主要错误类型就是插入-缺失, 而不是碱基替换. 454 另一个缺点是因为它依赖于包含一系列酶焦磷酸检测, 与其它下一代测序技术相比, 其试剂价格

36、相对较高.核酸测序技术分析解析第55页Solexa-Illumina Genome Analyzer关键技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。原理：将基因组DNA随机片段附着到光学透明玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是含有数千份相同模板单分子簇。然后利用带荧光基团四种特殊脱氧核糖核苷酸，经过可逆性终止SBS（边合成边测序）技术对待测模板DNA进行测序。核酸测序技术分析解析第56页核酸测序技术分析解析第57页Fragment DNA and ligate adaptors核酸测序技术分

37、析解析第58页核酸测序技术分析解析第59页核酸测序技术分析解析第60页Solexa-Illumina特点dNTP3羟基被化学方法保护，当荧光信号统计完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP3羟基保护基团，方便进行下一轮测序反应因为光信号衰减以及误差累积，读长较短，使用对读测序，能够到达2*75bp很好地处理了同聚物长度准确测量问题。Solexa技术主要错误起源是核苷酸替换，而不是插入或缺失后续序列拼接工作比较复杂核酸测序技术分析解析第61页SOLiD ABI(Applied Biosystems)：SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation

38、 and Detection)原理 ：用连接法测序取得基于“双碱基编码原理”SOLiD颜色编码序列，随即数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列质量信息发觉潜在SNP位点。 核酸测序技术分析解析第62页SOLiD流程1、SOLiD基因组文库构建 核酸测序技术分析解析第63页SOLiD流程2、微乳滴PCR 核酸测序技术分析解析第64页SOLiD流程3、含DNA模板P1磁珠固定 核酸测序技术分析解析第65页SOLiD流程4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程 核酸测序技术分析解析第66页S

39、OLiD流程4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程 核酸测序技术分析解析第67页核酸测序技术分析解析第68页SOLiD流程5. 数据分析原理 核酸测序技术分析解析第69页SOLiD特点SOLiD技术每个循环能够测两个上样玻片，读取长度可达250bp，与Solexa技术类似，后续序列拼接工作也比较复杂。SOLiD技术每个循环数据产出量为10-15 Gb，耗时约为6-7天。因为采取两碱基测序，该技术准确率能到达99.94 %以上核酸测序技术分析解析第70页第三代测序技术近期出现Helicos企业Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences企业SMRT技术和Oxford N

40、anopore Technologies企业正在研究纳米孔单分子技术， 被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大特点是单分子测序。Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不一样碱基产生电信号进行测序。核酸测序技术分析解析第71页第三代测序技术核酸测序技术分析解析第72页核酸测序技术分析解析第73页FASTQ FormatASCII textNo standard file extension: but .fq .fastq and .txt are commonly used4 lines per sequenceLine 1 begins

41、 with the character, a sequence ID, and an optional descriptionSimilar to the line in a FASTA fileLine 2 is the sequence lettersLine 3 begins with the + character, followed by the same sequence ID, and another optional descriptionLine 4 encodes quality values for the sequence letters in line 2Must c

42、ontain the same number of characters as the sequence in line 2核酸测序技术分析解析第74页FASTQ exampleSEQ_IDGATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT+!*(*+)%+)(%).1*+*)*55CCFCCCCCCC65核酸测序技术分析解析第75页FASTQ formatLine 2 (sequence characters) and Line 4 (quality value characters) may be wrapped (sp

43、lit over multiple lines).Wrapping is discouraged because it makes parsing more complicated核酸测序技术分析解析第76页Encoding Phred Quality ScoresPhred scores are presented on Line 4 of a FASTQ file:!*(*+)%+)(%).1*+*)*55CCFCCCCCC65 These characters are the ASCII value found by adding 64 to the Phred Quality scor

44、eIn version 1.3 of the Illumina software, the Phred values 0-62 can be encoded as ASCII 64-126Values greater than 40 are not expected in raw read dataIn the newest version of the Illumina pipeline software, Phred scores 0 and 1 are no longer used. A Phred score of 2 (ASCII 64, B) is now only used at

45、 the end of a read.Phred 2 is now a read segment quality control indicator 核酸测序技术分析解析第77页NAR(Nucleic Acid Research)数据库分类：核酸序列数据库(Nucleic Acid Sequence)基因表示数据库(Gene Expression)比较基因组学数据库（Comparative genomics）基因识别与基因结构数据库（Gene Identification and Structure）核酸测序技术分析解析第78页遗传与物理图谱数据库(Genetic and physical m

46、aps)基因组数据库(Genomic Databases)分子相互作用数据库(Intermolecular interactions)代谢路径和细胞调整数据库(Metabolic Pathways and Cellular Regulation)突变数据库(Mutation Databases)病理数据库(Pathology)核酸测序技术分析解析第79页蛋白质数据库(Protein Databases)蛋白质模体数据库(Protein sequence Motifs)蛋白质组数据库(Proteome Resources)RNA序列数据库(RNA Sequences)结构数据库(Structur

47、e)核酸测序技术分析解析第80页核酸序列数据库一、国际上权威核酸序列数据库 （1）美国生物技术信息中心GenBank /Web/Genbank/index.html （2）欧洲分子生物学试验室EMBL http:/www.embl-heidelberg.de （3）日本遗传研究所DDBJ http:/www.ddbj.nig.ac.jp/核酸测序技术分析解析第81页核酸序列数据增加趋势（纵轴代表总核酸序列长度，单位：百万bp）核酸测序技术分析解析第82页三大数据库之间联络核酸测序技术分析解析第83页NCBI主要资源GenBank数据库核酸测序技术分析解析第84页 Search Human al

48、ternatively spliced mRNA sequencesGenBank Search核酸测序技术分析解析第85页 A sample GenBank record.核酸测序技术分析解析第86页核酸测序技术分析解析第87页核酸测序技术分析解析第88页 Saving search results. 核酸测序技术分析解析第89页GenBank数据格式Definition: 标题序列长度数据类型Accession number版本号GI number核酸测序技术分析解析第90页FASTA格式核酸测序技术分析解析第91页蛋白质序列数据库Protein Information Resource,

49、 PIR ()SWISS-PORT (http:/www/expasy.ch/sprot/)TrEMBL (http:/www.ebi.ac.uk/trembl/)OWL (http:/www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/OWL/), composite of SWISS-PROT, PIR, GenBank and NRL-3D.核酸测序技术分析解析第92页Properties of PIR-PSD and Swiss-Prot核酸测序技术分析解析第93页目标：帮助研究者判别和解释蛋白质序列信息，研究分子进化、功效基因组。它是一个全方面、经过注释、非冗余蛋白质序列数

50、据库。 全部序列数据都经过整理，超出99%序列已按蛋白质家族分类，二分之一以上还按蛋白质超家族进行了分类。PIR（Protein Information Resource）核酸测序技术分析解析第94页除了蛋白质序列数据之外，PIR还包含以下信息： (1)蛋白质名称、蛋白质分类、蛋白质起源； (2)关于原始数据参考文件； (3)蛋白质功效和蛋白质普通特征，包含基因表示、翻译后处理、活化等； (4)序列中相关位点、功效区域。核酸测序技术分析解析第95页PIR提供三种类型检索服务:一是基于文本交互式查询，用户经过关键字进行数据查询。二是标准序列相同性搜索，包含BLAST、FastA等。三是结合序列相

51、同性、注释信息和蛋白质家族信息高级搜索，包含按注释分类相同性搜索、结构域搜索等。核酸测序技术分析解析第96页SWISS-PROT SWISS-PROT (http:/www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html）是当前国际上比较权威蛋白质序列数据库,其中蛋白质序列是经过注释 SWISS-PROT中数据起源于不一样源地：（1）从核酸数据库经过翻译推导而来；（2）从蛋白质数据库PIR挑选出适当数据；（3）从科学文件中摘录；（4）研究人员直接提交蛋白质序列数据 SWISS-PROT有三个显著特点 ：核酸测序技术分析解析第97页1）注释在SWISS-PROT中，数据分为关键数据

52、和注释两大类。关键数据包含：序列数据、参考文件、分类信息（蛋白质生物起源描述）注释包含： （A)蛋白质功效描述； (B)翻译后修饰； (C)域和功效位点，如钙结合区域、ATP结合位点等； (D)蛋白质二级结构； (E)蛋白质四级结构，如同构二聚体、异构三聚体等； (F)与其它蛋白质相同性； (G)因为缺乏该蛋白质而引发疾病； (H)序列矛盾、改变等。核酸测序技术分析解析第98页2）最小冗余 尽可能将相关数据归并，降低数据库冗余程度。 假如不一样起源原始数据有矛盾，则在对应序列特征表中加以注释。3）与其它数据库连接对于每一个登录项，有许多指向其它数据库相关数据指针，这便于用户快速得到相关信息。

53、现有交叉索引有： 到EMBL核酸序列数据库索引， 到PROSITE模式数据库索引， 到生物大分子结构数据库PDB索引等 。核酸测序技术分析解析第99页PDB（Protein Data Bank）PDB中含有经过试验（X射线晶体衍射，核磁共振NMR）测定蛋白质分子三维结构。核酸测序技术分析解析第100页一个是显式序列信息（explicit sequence）在PDB文件中，以关键字SEQRES作为显式序列标识，以该关键字打头每一行都是关于序列信息。 一个是隐式序列信息(implicit sequence) PDB隐式序列即为立体化学数据，包含每个原子名称和原子三维坐标。 核酸测序技术分析解析第101页Customizing the PDBs SearchFields formSearch PDB核酸测序技术分析解析第102页核酸测序技术分析解析第103页HEADER HYDROLASE 19-FEB-97 1ADZ TITLE THE SOLUTION STRUCTURE OF THE SECOND KUNITZ DOMAIN OF TITLE 2 TISSUE FACTOR PATHWA