临床微生物学检验精选课件

1、临床微生物学检验精选临床微生物学检验精选一、临床微生物学检验的意义 对一个感染病人来说，细菌培养无疑是非常必要的，有一个准确的培养结果能很好地帮助临床医生用药有的放矢，避免盲目用药给病人带来沉重的经济负担，同时也可以减少盲目用药造成的大量耐药菌株的产生。 一、临床微生物学检验的意义 对一个感染病人来二、细菌室开展的业务范围 临床微生物包括细菌、真菌、病毒等一大类微小生物。但象衣原体、螺旋体及病毒等不能在无生命活性的人工培养基中生长繁殖，只能通过细胞培养才能达到目的。细菌室应该能开展能在无生命活性培养基中生长的所有细菌，还有真菌。二、细菌室开展的业务范围 临床微生物包括细菌三、分析前的质量控制

2、分析前质量控制是我国目前临床实验室诊断质量保证中较为薄弱的环节，严重影响临床微生物学实验室对感染样本中致病菌的分离培养的阳性率和医院感染病原体监控，也影响临床诊断，合理选用抗菌药物，降低耐药菌的产生和提高感染的治愈率，而且对预测或及时发现医院感染的暴发流行、杜绝感染蔓延、研究医院感染的发病机制和环节、制定有效的医院感染控制措施等，均具有十分重要的意义。严格实施正确的微生物标本送检和检验方法，是做好医院感染病原体监测的关键。三、分析前的质量控制 分析前质量控制是我国（一）医院感染标本的采集和运送的基本原则发现医院感染应及时采集微生物标本作病原学检查，二、三级医院微生物标本送检率不应低于70%。尽

3、量在抗菌药物使用之前采集标本。标本采集时应严格执行无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其他杂菌污染。标本采集后应立即送至实验室，床旁接种可提高病原菌检出率。（一）医院感染标本的采集和运送的基本原则发现医院感染应及时采以棉拭子采集的标本如：咽拭、肛拭或伤口拭子，立即送检。盛标本容器须经灭菌处理，但不得使用消毒剂。送检标本应注明来源和检验目的，使实验室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境，必要时应注明选用何种抗菌药物。以棉拭子采集的标本如：咽拭、肛拭或伤口拭子，立即送检。（二）常见医院感染标本送检方法血液与骨髓尿液痰液伤口、烧伤创面与脓液粪便咽拭、口腔拭子浆膜腔积液、脑脊液生殖道标本组织标本静脉导

4、管（二）常见医院感染标本送检方法血液与骨髓咽拭、口腔拭子标本送检方法 -血液与骨髓 如怀疑病人患有感染性系统性炎症反应综合征，需要采血进行培养，另外当新生儿出现原因不明的黄疸时，应想到败血症的可能并早期采血做培养。如果一次血培养阴性又高度怀疑败血症时，应反复做血或感染灶的渗出物的细菌培养以提高阳性率。 标本送检方法 -血液与骨髓 如怀疑病标本送检方法 -血液与骨髓 通常采血部位为肘静脉。疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉或股动脉采血为宜。切忌在静滴抗菌药物的静脉处采取血标本。 采血部位的局部皮肤应严格消毒。将采集的血液注入血培养基前，应过火消毒针头，最新资料显示更换针头容易造成新的污染。血培养瓶应

5、在避光室温中保存，不必置冰箱保贮。 每次采血量成人5-10ml，婴幼儿l-5ml，培养基与血液之比以 10：1为宜，以稀释血液中的抗生素、抗体等杀菌物质。为提高阳性率，我们一般要求成人采血不少于8 ml，儿童不少于3 ml，婴儿1-2 ml。 标本送检方法 -血液与骨髓 通常采血部位为肘静脉。疑似细标本送检方法 -血液与骨髓 怀疑菌血症应尽早采血，体温上升阶段采血可提高阳性率，但要防止因等待而延误时机。对已用抗菌药物而又不能停药者，可在下次用药前采血。 每例至少采血两次，间隔0.5-1h，以利于提高阳性率和区分感染菌与皮肤污染菌。感染性心内膜炎在24小时内采血三次做血培养。 对疑为细菌性骨髓炎

6、或伤寒病人，在病灶部位或髂前(后)上棘处严格消毒后抽取骨髓lml作增菌培养。标本送检方法 -血液与骨髓 怀疑菌血症应尽早采血，体温上标本送检方法 -尿液 中段尿：女性采样前应先用肥皂水或0.1高锰酸钾溶液冲洗外阴部及尿道口；男性须翻转包皮冲洗，用O.1新洁尔灭消毒尿道口灭菌纱布擦干后收集标本。 导尿管导尿采样可减少污染。对留置导尿者，可用碘酒消毒尿道口处的导尿管壁，用空针细针头斜穿管壁抽吸尿液。或消毒后解开接口，弃去导尿管前段尿被、留无污染的膀胱内尿液数毫升送检。不可从集尿袋的下端管口留取标本。标本送检方法 -尿液 中段尿：女性采样前应先用肥皂水或0标本送检方法 -尿液 尿厌氧菌培养，或婴幼儿

7、中段尿采集困难，或培养结果与病情不符时，可经耻骨上皮肤穿刺采集无污染的膀肮内尿液。 送检标本以晨起第一次尿液为佳。 室温下尿标本耽搁稍久，可致尿内细菌浓度明显增加而影响病原菌与污染菌的区分。不能立即送检者，可暂存4冰箱，一般不存放。标本送检方法 -尿液 尿厌氧菌培养，或婴幼儿中段尿采集困标本送检方法 -痰液 咳痰：清水反复漱口后用力咳嗽，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于无菌容器送检。痰量极少者可用45lO氯化钠液雾化吸入导痰。 对咳嗽乏力或昏迷病人，可用吸痰管经鼻腔或口腔抵达气管腔内吸引痰液。用纤维支气管镜可直接在病灶部位采集高浓度的感染病原菌，但不能完全避免咽喉部正常菌群污染。双侧肺部感染伴人工气

8、道如气管切开或气管插管思者，可用吸痰管经人工气道估插至肺支气管水平吸引痰液。标本送检方法 -痰液 咳痰：清水反复漱口后用力咳嗽，从呼标本送检方法 -痰液 对重症、难治、或伴免疫抑制、或疑似厌氧菌引起的医院内肺部感染可采用环甲膜穿刺经气管吸引(TTA)、经胸壁穿刺肺吸引(LA)、经纤维支气管镜或人工气道作防污染双套管毛刷(PSB)或防污染支气管肺泡灌洗(PBAL)采集无口咽部菌群污染的痰液，进行精确的感染病原学诊断。 痰标本不能及时送检者，可暂存4冰箱。室温下延搁数小时，定植于口咽部的非致病菌呈过度生长，而肺炎球菌、葡萄球菌和流感杆菌检出率则明显下降。标本送检方法 -痰液 对重症、难治、或伴免疫

9、抑制、或疑似标本送检方法 -伤口、烧伤创面与脓液 无菌生理盐水擦洗病灶表面后用棉拭子取病灶深部的脓液和分泌物，置运送培养基内送检。 对未渍破的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤后，以无菌注射器抽取脓液送检：也可于切开排脓时用无菌棉拭子采样。标本送检方法 -伤口、烧伤创面与脓液 无菌生理盐水擦洗病标本送检方法 -粪便 排便后，挑取有脓血、粘液部分的粪便约23g(液状粪便则取絮状物)，盛于灭菌广口瓶或蜡纸盒送检。用棉拭挑取粪便插入CnryBLair运送培养基或PH70的磷酸盐甘油中送检，可提高病原菌检出率 对不易获取粪便者或婴幼儿，可用肠拭于(又称肛拭)采集。将拭子前端用无菌甘油水湿润然后插入肛门约45c

10、m(幼儿约23cm)处，轻轻旋转擦取肠表面粘液后退出置运送培养基内送检。标本送检方法 -粪便 排便后，挑取有脓血、粘液部分的粪便标本送检方法 -咽拭、口腔拭子 病人清水嗽口后由检查者将其舌外拉使悬雍垂尽可能向外牵引，锦拭子越过舌根到咽后壁或悬雍垂的后侧，反复擦拭数次，插入运送培养基。棉拭子应避免触及舌、口腔粘膜和唾液。 对化脓性扁桃体炎或口腔念珠菌病，用棉拭子在病灶部位擦拭数次即可。标本送检方法 -咽拭、口腔拭子 病人清水嗽口后由检查者标本送检方法 - 浆膜腔积液、脑脊液 浆膜腔积液包括胸水、腹水如心包液、关节液和鞘膜液等以严格无菌操作抽取数毫升液体置无菌试管或小瓶送检。对易自凝的标本可添加抗

11、凝剂。 严格无菌操作下采取脑脊液数毫升于无菌试管。标本采集后应立即送检，以防细菌死亡。疑似有脑膜炎奈瑟菌时，应注意保暖，不可置冰箱保存。标本送检方法 - 浆膜腔积液、脑脊液 浆膜腔积液包括胸水标本送检方法 - 生殖道标本 根据不同感染种类和病变特征采集不同的标本。采集尿道标本时，先用生理盐水局部清洗，以无菌棉拭子插入尿道口 l-2cm停留十余秒钟。轻轻旋转拭子后退出 对外阴部糜烂、溃疡者，生理盐水清洗后用棉拭子擦取病灶边缘的分泌物。 阴道和官颈口分泌物须在窥阴器下用长棉拭采集。标本送检方法 - 生殖道标本 根据不同感染种类和病变特征标本送检方法 - 生殖道标本 子宫内分泌物需用无菌导管抽取导管

12、外套一层保护膜，插入子宫后再刺穿该膜予负压吸引，可减少阴道菌群污染。 女性盆腔脓肿，应在阴道局部消毒后，由直肠子宫凹陷处进针抽取。 前列腺液需进行前列腺按摩获取。标本送检方法 - 生殖道标本 子宫内分泌物需用无菌导管抽标本送检方法 - 组织标本 表浅的感染组织和各种窦道标本可用棉签擦拭、小刀刮取、穿刺抽吸或手术切除。对窦道和痰管应深部刮取管壁组织。 深部组织标本可经皮肤穿刺采集或手术切取。标本置无菌容器并加少量生理盐水以保湿度，或置肉汤增菌液，或置血平皿送检。 尸检标本应于死后20h内采取，以防肠道等菌群侵入引起污染。 作病原体分离的组织标本，不可用福尔马称固定。疑有污染的较大组织块，可用烧红

13、的烙铁烧灼其表面或置沸水中510秒钟使表面变白消除污染后，再用无菌器械切开组织，取中央部位组织送检。标本送检方法 - 组织标本 表浅的感染组织和各种窦道标本标本送检方法 - 静脉导管 从病人体内拔出静脉插管，用无菌技术剪去导管体外部分。体内段导管立即置血平皿上作滚动涂布接种。不能作床旁接种者，将导管置含有少量生理盐水的无菌试管内送检。 也可将剪下的导管体内段置肉汤增菌液或用于血培养液内，但不能区分导管感染菌与少量的定植菌。标本送检方法 - 静脉导管 从病人体内拔出静脉插管，用无四、细菌鉴定及药敏试验的质量控制 医学领域中，临床细菌学工作者需要从各种临床标本中分离并识别出细菌是病原菌还是正常菌群

14、或是条件致病菌，并将导致感染的病原菌按照分类学方法正确地鉴定到属或种。而由于细菌的结构和形态较为简单，仅仅依靠形态学特征无法准确区分。因此，需要结合细胞学、生理学、生物化学、免疫学等特征，同时以抗原结构特点、遗传物质的分子结构来阐明各种细菌间的亲缘关系，从而在分类体系中准确地定位。因此，细菌鉴定是一项操作繁琐、技术难度较大的工作。四、细菌鉴定及药敏试验的质量控制 医学领域（一）细菌鉴定的基本原理（一）细菌鉴定的基本原理细菌鉴定的几种方法：双歧索引法：确定细菌的主要特征和次要特征，根据确定的反应次序按照“非此即彼”的原则依次往下区分，直至将细菌准确区分到最小鉴定单位即属或种的水平。该方法适于手工

15、操作，较为繁琐。数值分类法：该方法以细菌的各种特征同等重要为理论基础，根据每种生化反应特性在不同细菌中出现的概率进行全面分析。通过比较待测菌与分类体系中已知菌的生化特性的相似性，判断待测菌的归属。该方法适于计算机进行大量的数据运算，是自动化分析仪器普遍采用的方法。细菌鉴定的几种方法：双歧索引法：确定细菌的主要特征和次要特征这两种方法都是对细菌的表型进行分类，现在又提出一种分类方法即核酸分类法，以细菌的遗传物质DNA为分析对象对细菌进行分类，反映了细菌的本质特征，从理论上讲应该是一种客观的分类方法。这两种方法都是对细菌的表型进行分类，现在又提出一种分类我们细菌室目前使用的仪器细菌鉴定的数值编码鉴

16、定系统原理：我们细菌室目前使用的仪器细菌鉴定的数值编码鉴定系统原理：编码 以数值分类法为基础，筛选一组具有代表性的生化反应试验。每一种生化反应只有“阳性”和“阴性”两种可能性，计算机识别为“1”和“0”这两个二进制数字。 由于每种反应在试验组合中的位置不同，其阳性值按照“4、2、1位置计数法”分别转换为4、2、1等数，阴性值则为0。 编码 以数值分类法为基础，筛选一组具有代表性的生化反应试验。每三个生化反应的数值相加，得到一个八进制的数字。15个生化反应分为5组，从而得到一个八进制的5位数，此即为用于细菌鉴定的编码。 分类体系中的每种细菌均根据其15个生化反 应结果的可能组合确定所有可能的编码

17、。由于一种细菌可以有多种反应模式，因而也对应多个编码。而同一个编码也可能对应多种细菌。 每三个生化反应的数值相加，得到一个八进制的数字。15个生化反几率的计算 每种细菌对于各种生化反应结果为阳性的几率各不相同，对应于编码的15种反应的几率的乘积即为该细菌出现此编码的几率。一种细菌可能出现的所有编码所对应的几率之和应该等于1。 1、如果一个编码只对应一种细菌，无论其几率的大小，可能为该种细菌的可能性（ID%）均为99.99%。 2、如果一个编码对应两种以上的细菌，应该计算每种细菌出现几率所占的百分比（即ID%）。若ID%99%，为该细菌的可能性极大；ID%90%，为该细菌的可能性较大；ID%80

18、%，为该细菌的可能性较大，但需要补充试验进一步确证。ID%80%，则无法区分为哪一种细菌，需要通过补充试验进一步区分。 几率的计算 每种细菌对于各种生化反应结果为阳性的几率各不相同细菌生化反应及其结果的判断： 细菌的生化反应主要检测细菌对于各类化学物质（碳水化合物、氨基酸及蛋白质、无机盐类等）的代谢能力以及酶类的存在与否等生化特性。这些反应能够导致反应体系的PH值变化或产生显色物质，加入合适的酸碱指示剂或显色剂就可以反映出来。 细菌生化反应及其结果的判断： 细菌的生化反细菌鉴定自动分析过程 ：仪器对生化反应结果的判断 根据细菌生化反应的显色原理利用比色法进行分析。每一种反应阳性和阴性的色谱值均

19、不同，据此可以设定每种反应的临界值。机器由分析程序控制，自动读取通过微孔的透射光，分析其色谱值并与临界值相比较，判断出反应结果是阳性还是阴性。 细菌鉴定自动分析过程 ：仪器对生化反应结果的判断 编码的转换与分析 系统将每种反应的结果转换为八进制的5位数编码，将该编码与系统内的细菌数据库比较，查找出对应的细菌及其可能出现的概率。如果编码无法准确区分细菌，系统自动检索相关的补充试验将其进一步鉴定。 报告结果：系统自动将出现概率最大的细菌作为鉴定的结果报告。 编码的转换与分析 系统将每种反应的结果转换为八进制药敏试验的原理药敏试验的原理基本概念 基本概念 抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：

20、用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。通常根据MIC结合常用剂量时体内该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗生素敏感或耐药的界限，给出S（敏感）、I（中介）、R（耐药）等定性的结果，方便临床用药。 抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：用于测试抗菌药物药敏试验的目的 检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理用药。 （2） 用于流行病学调查及院内感染的监控，控制和预防耐药菌株的流行。 （3） 为经验用药提供参考依据。 药敏试验的目的 检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理常用的药敏测定方法 扩散法（

21、纸片法）：手工测试的方法，通过测试药物纸片在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。目前临床上广泛使用此法。 E测定法（E test）：与扩散法相似，但药物包被于长塑料条上，能够精确测定MIC值。适于一些特殊病原菌的药敏测试，但价格较为昂贵。 稀释法：有琼脂稀释法和液体稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。自动化仪器均采用液体稀释法为药敏试验的方法。 常用的药敏测定方法 扩散法（纸片法）：手工测试的方法，通过测药敏试验和抗菌药物的规则 药敏试验和抗菌药物的规则 抗菌药物的选择原则 针对不同类别的细菌，应该有选择的进行抗菌药物敏感试

22、验。不同细菌需要测试的药物可能有所不同。如红霉素用于葡萄球菌的测试而不用于肠杆菌的测试。 （2）不需要对每种抗生素均进行测试。选择的药物应该为各类抗生素的代表性药物。 （3） NCCLS（美国临床实验室标准委员会）将测试药物根据不同细菌 分为4组。A组为首选药物必须常规报告；B组为与A组平行的药物，但可以选择性报告；C组为补充药物，当对A组、B组药物呈现多重耐药时必须报告；D组为用于尿路感染测试的药物。 （4） 每种药物需要测试的药物浓度各不相同，对应的敏感或耐药的MIC值也不相同，NCCLS在经过认真地验证后给出了相应的判断标准。 抗菌药物的选择原则 针对不同类别的细菌，应该有选择的进行抗菌

23、药敏试验结果的解释 MIC：体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度，临床医师可以根据MIC确定药物剂量。通常达到稳态的血药峰浓度（Css）max应为MIC的4-8倍，重症感染以大于8倍为妥。 （2） 为方便临床给药，根据MIC提供一个定性的结果是必要的。临床医师根据敏感、中介、耐药的提示结合MIC可以方便地制定用药方案。 药敏试验结果的解释 MIC：体外能够抑制细菌生长的最低药物浓敏感（S）：表示该药物对细菌的MIC值低于常规剂量下的抗菌药物血液浓度或组织浓度4-8倍，可以用常规剂量治愈。 中介（I）：表示该药物对细菌的MIC值接近于常规剂量给药后的血药浓度或组织药物浓度，细菌对该药的敏感性降低，

24、但仍可用于生理性浓集部位的感染或使用高剂量药物进行治疗（注：必须考虑高剂量的安全性）。 耐药（R）：表示该药物对细菌的MIC值等于或高于常规剂量下药物的血液浓度或组织浓度，细菌不能被该种药物抑制。 敏感（S）：表示该药物对细菌的MIC值低于常规剂量下的抗菌药药敏试验自动分析的原理 细菌在药物微孔中的生长情况： 每种抗菌药物按照NCCLS所规定的三个倍比稀释测试浓度，分别包被在3个微孔中，微孔中另外还包被有适于细菌生长的培养基。待测菌制备成菌悬液接种于药物微孔中。细菌如果在某孔内生长，表示该孔的药物浓度不能抑制细菌的生长，该孔内呈现浑浊，透光度明显下降。反之，该孔内为澄清，透光度下降不显著。 2

25、、机器由分析程序控制，利用透射光自下向上逐孔检测。光敏元件自动接收透射光。接收到的透射光强度值自动与系统设定的临界值相比较，大于临界值判断为细菌不生长，该孔的结果为阴性；小于临界值则判断为细菌生长，该孔的结果为阳性。 3、MIC值的判断： 每种药物的5个测试孔中，结果为阴性的最低浓度孔的药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。若5个测试孔结果均为阳性，最低抑菌浓度（MIC）应该大于最高浓度孔的药物浓度。 4、系统自动根据每种药物的MIC值，判断待测细菌对该药的敏感性并给出一个定性的结果（敏感、中介或耐药）。 药敏试验自动分析的原理 细菌在药物微孔中的生长情况： 实际工作中常常遇到的问题 实际工作中

26、常常遇到的问题 1.敏感的药物是否都可以使用？不是。第一.体外试验结果敏感并不代表其体内实际情况。结果为敏感的药物可能使用无效。这与药物的药代动力学特点及其他因素有关。如头孢唑林对于血脑屏障穿透性较差，因此不用于中枢神经系统感染的治疗。第二.病人的个体情况可能会限制某些药物的使用。如慢性肾功能衰竭患者，不宜使用四环素类、磺胺类、氯霉素类等药物，氨基糖甙类药物则须根据病人个体情况确定用量。孕妇、儿童不宜使用喹诺酮类药物。第三.某些细菌呈现对某些抗生素的固有耐药，即使体外敏感也不应使用。如耐甲氧西林的金葡菌（MRSA）对于所有的-内酰胺类药物耐药。肠道内的沙门氏菌感染，只应选用氨苄西林、喹诺酮类、

27、复方新诺明的一种，头孢类通常无效。又如，嗜麦芽窄食单孢菌、洋葱伯克菌对于亚胺培南天然耐药；鸡肠球菌对于万古霉素天然耐药。由上可知，体外药物敏感实验不能保证在人体内具有相同的结果，但并不能因此忽视了其重要的指导意义。实际上，我们应该称其为耐药筛选试验，只有“耐药”才具有确切的意义。在体外检查为耐药时，临床应避免使用此药。对于检查结果为敏感的药物，只是向临床提供了一个选择的范围。最终的决定权在医生手中。临床不应该简单地将治疗效果不好归咎于药敏试验结果不准确，因为影响治疗效果的因素很多。加强临床与细菌室的交流有助于提高药敏试验的针对性和临床符合率。1.敏感的药物是否都可以使用？不是。2.细菌鉴定与药

28、敏试验的结果之间有联系吗?这两者不是相互独立的两项工作，而有其一定的内在联系。药敏试验的结果必须结合病原菌类型才具有确切的临床意义。正确地将细菌分类才能够有目的选择一定范围的药物进行药敏试验。用于肠杆菌、非发酵菌、葡萄球菌、链球菌等不同细菌的抗生素通常是不同的。例如，青霉素G、大环内脂类（红霉素、阿齐霉素等）可以用于葡萄球菌引起的感染，但对于大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等肠杆菌所致感染无效。细菌鉴定的结果可以帮助检查药敏试验的可靠性。例如，用于革兰氏阴性杆菌的氨苄西林对于克雷伯氏菌通常是无效的。铜绿假单孢菌对于酶抑制剂不敏感，因此，含舒巴坦、克拉维酸、他唑巴坦等酶抑制剂的复合药物并不能改变MIC值及药敏试验结果。药敏试验的结果也可以帮助验证细菌鉴定的准确性。一些细菌对某些药物具有天然耐药性如奇异变形杆菌对于四环素、沙雷氏菌对于头孢唑林等，这些特征可以用于验证细菌鉴定的结果。对于某些细菌，需要进一步检查是否具有特殊耐药机制。有鉴于此，临床与细菌学工作者不应厚此薄彼，片面关心某一方面。双方应认识到细菌鉴定与药敏试验