植物生理实验指导 - 生命科学学院本科基础实验教学中心

1、丙酮 碳酸钙. 三、实 验 步 骤. 1提取叶绿素. 取新鲜植物叶片数张剪碎、混匀，于台天平上称取0.2g共三份，置于研钵中，加少许碳酸钙和石英砂及2ml95%乙醇，仔细 .本文档由无尘大哥上传至豆丁网实验一 植物组织渗透势的测定质壁别离法一、原 理 成长的植物细胞是一个渗透系统，当把细胞置于一定浓度溶液中时，当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，且此时植物细胞内的压力势为零时，那么细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称之为等渗浓度。当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁别离现象时，细胞的等渗透浓度将界于刚刚引起初始质壁别离的浓度和与其相邻的尚不能引起质壁别离的浓

2、度梯级之间的溶液浓度。代入公式即可计算出其渗透势二、仪 器 药 品显微镜 载玻片及盖玻片 镊子 刀片 培养皿8套 滤纸1M蔗糖溶液 滴管三、实 验 步 聚1梯度浓度溶液的配制：用1M蔗糖溶液为母液，分别吸取8，7，6，5，4，3，2ml溶液于试管中，各参加蒸馏水至10ml，即成0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2M的梯度溶液。用移液管，从0.2M依次取一定量的溶液3ml，盛于培养皿内，盖上盖，贴上标签待用。2将带有色素的植物组织叶片，一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮，紫鸭跖草，苔藓，红甘蓝及黑藻，丝状藻等水生植物，也可用乔豆，玉米、小麦等作物叶的表皮。用镊子撕取下表皮，迅速分

3、别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，3510分钟后，从0.5M开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察是否所有细胞都产生质壁别离的现象，实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上别离的浓度，和不引起质壁别离的最高浓度。取二者的平均值为等渗透势。4按照公式把等渗浓度换算成渗透势，以MPa表示之。=RTiC表示欲测渗透势，MPa；R表示气体常数：0.008314( MPa L/MK)；T表示绝对温度，即(273+t) K；i 表示解离系数，蔗糖等于1。C表示等渗溶液的浓度，那么： =0.008314(273+ t)1C蔗糖克分子浓度M渗透势

4、巴质壁别离的相对程度作图表示0.50.450.400.350.300.250.200.150.10测出引起质壁别离刚开始的蔗糖溶液浓度和与其相邻的不引起质壁别离最高浓度之后，可按以下公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。【思考题】质壁别离法除了用于细胞渗透势测定外，还有什么用处？ 实验二 植物组织水势的测定小液流法一、原 理水势表示水分的化学势，象电流之由高电位处流向低电位处一样，水从水势高处流向低处代表水的能量水平。植物体组织之间，细胞之间以及植物体及环境间的水分移动方向都由水势差决定。当植物细胞或组织放在溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势溶质势，那么组织吸水而使溶液浓度变大；反之，

5、那么植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；假设植物组织的水势与溶液的渗透势相等，那么二者水分保持动态平衡，外部溶液浓度不变，此溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液浓度的变化。然后根据公式 计算其渗透势。二、仪 器 药 品试管 毛细吸管尖端弯成900移液管 剪刀 镊子 次甲基蓝 三、实 验 步 骤1首先配制一系列浓度递增的蔗糖溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8M各10ml，注入试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序排成一列，放在试管架上，作为对照组。2另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然

6、后由对照组中之各试管中分别取溶液4ml移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。3用剪刀将菠菜叶剪成大小相等的小块，约4050片。向试验组的每一试管中各加相等数目的叶片小块，塞好塞子，放置30分钟，在这段时间内摇动数次，到时间后，向每一试管中各加次甲基蓝粉末少许，并振荡，使溶液着色均匀。4用毛细吸管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部，缓慢放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液流移动的方向，并记录之。观察液滴移动的方向：0.10.20.30.40.50.60.70.8液滴方向5计算记录小液流不动的试管中蔗糖溶液的浓度，按=RTiC计算水势值。【思

7、考题】1测定同一植物上部及下部叶片的水势有何差异。2用小液流法测定植物组织水势与用质壁别离法测定植物细胞渗透势都是以外液的浓度算出的溶质势为根据，他们之间的区别何在。实验三 小孔的扩散一、原 理气孔蒸腾是植物散失水分的主要途径，气孔口很小，其总面积一般不超过叶面积的1%，可是叶子通过气孔蒸腾所损失的水分却到达与叶面积相等的自由外表的5080%，如此惊人的蒸腾量，可以用小孔扩散原理加以说明。水分通过小孔扩散的量和小孔的周缘长度成正比，而和小孔的面积不成比例。通过此试验所产生的现象，可以证明小孔边缘效应的存在。二、仪 器 药 品小烧杯 台秤 培养皿 刀片尺及解剖针 卡片纸 1%琼脂 石蜡红墨水或蓝

8、墨水 酒精或丙酮 三、实 验 步 骤1物质通过小孔扩散的途径 配置1%琼脂放入一小烧杯中，如用10ml小烧杯，那么更易于观察待冷却凝固后，熔化少量石蜡温度不能太高，倒在已凝固的琼脂外表上，使成一薄层盖住琼脂凝胶外表，待其凝固后，取一解剖针在酒精灯上烧热，小心地将石蜡薄膜熔成一小孔，注意不要把凝胶穿刺成孔，然后，于其上倾注有色溶液少许。45小时后即可看到有色溶液通过小也向琼脂凝胶中扩散，形成一个具有颜色的半球形，它说明了颜料通过小孔扩散的途径。将卡片纸剪成与培养皿大小一致的圆片，然后在一张卡片纸的中部剪成一正方形大孔，每边长3cm，那么面积为9cm2。在另一卡片纸上剪成数个小孔，其总面积与大孔完

9、全相等。为此将其剪成9个每边长1cm的正方形小孔，并使其均匀地分布在圆形卡片纸上，再将此卡片纸浸于熔化的石蜡中，取出盖于培养皿上，并用石蜡将边缘封严。于两皿中各参加等量的酒精或丙酮，将此皿分别置于台秤两边用酒精调节使之平衡。隔1530分钟后，由于小孔具有较高的边缘效应，酒精蒸发较快，因此天秤指针倾向大孔一边，由此可看出孔的总面积虽相等，但酒精通过小孔的散失比大孔要快得多。证明小孔的边缘效应比大孔的边缘效应要大，因其周缘长度比大孔大。实验四 植物灰分常量元素分析一、原 理灰分元素是植物组织的组成成分。通常利用灰分元素与特殊试剂进行的专一性反响，产生一定形状的结晶和颜色，可以在显微镜下作定性鉴定。

10、所需灰分数量极少，乃为此方法的优点。二、仪 器 药 品显微镜 台天平高温电炉 烘箱大坩埚 白瓷比色板 盖玻片 载玻片下述溶液的浓度均为5%w/v:磷酸二氢钾 磷酸氢二钾硫酸镁 硫酸钾硫氰化钾 氯化钙15%过氯酸 10%氯化钡50%硫酸 镁试剂现配现用：10g Na3 PO4 及30g NH4Cl 溶于50ml蒸馏水中，参加40ml浓NH4OH，然后定容至100ml。钼酸铵试剂：7g钼酸铵溶于50ml蒸馏水中，参加50ml 6NHNO3，放置过夜，取上清液用。二苯铵试剂现配现用：1g二苯胺溶于100ml浓H2SO4中。三、实 验 步 骤1材料灰化 取50g新鲜植物材料，用水洗净后再用蒸馏水冲洗一

11、次，放于大坩埚内，置于100105烘箱中烘干，然后于高温电炉上灰化2小时，使材料变为白色为止。2鉴定 将1g灰分溶解于4ml10% HCl溶液中作如下检定：磷：放1滴5%的KH2PO4于干洁的载玻片上，并加1滴磷试剂，然后在显微镜下观察结晶的颜色和形状；用1滴灰分溶液作同样试验，观察其结果。钾：将1滴K2HPO4溶液于载玻片上，然后在其旁边滴上1滴钾试剂，小心将它们逐渐混合，显微镜下观察结晶颜色与形状；用1滴灰分溶液作同样试验，并观察其结果。镁：按上述方法，将1滴5%MgSO4和1滴镁试剂混合，显微镜子下观察结果颜色与形状；再用灰分溶液试验，观察其结果。硫：将1滴5%H2SO4和1滴硫试剂在载

12、玻片上混合，观察结晶颜色与形状；用灰分溶液试验，观察其结果。钙：将1 滴50%H2SO4和1滴5%CaCl2在载玻片上混合，观察结晶颜色与形状；用灰分溶液试验，观察其结果。铁：加5滴灰分溶液和3滴铁试剂于白瓷比色板上，观察是否有红色形成。3结果植物灰分常量元素分析记载表项目项目结果元素 反响方程式产物颜色结晶形状作用铁镁硫磷钾钙实验五 植物的溶液培养与矿质元素缺乏症一、原 理植物的生长发育除了需要充足的阳光和水分外，还需要矿质营养，否那么植物就不能很好地发育甚至死亡。应用溶液培养技术，可以观察矿质元素对植物生长的必需性。二、仪 器 药 品番茄幼苗三个以上真叶 1,000ml的培养缸 PH试纸

13、量筒 移液管 棉花 各矿质盐C. P.见培养液的准备三、实 验 步 骤1准备工作 1幼苗的准备：将西红柿、小麦等种子浸泡12小时，播入蛭石中，温室中培养，待苗长出三个以上真叶后，选择生长势相同的植株进行实验。2培养液的准备：A取化学纯药品配制以下贮备液 大量元素 微量元素药品名称 用量g/1 药品名称 用量g/1Ca(NO3)2 82.07 H3BO3 2.860 KNO3 50.56 MnSO4 1.015MgSO47H2O 61.62 CuSO45H2O 0.079KH2PO4 27.22 ZnSO47H2O 0.220NaNO3 42.45 H2MoO4 0.090MgCl2 23.81

14、 Na2SO4 35.51 CaCl2 55.50 KCl 37.28* Fe-EDTA: Na2-EDTA 7.45 FeSO47H2O 5.57* 溶解2,680mg EDTA在1,000ml蒸馏水中，加热，趁热参加2g FeSO47H2O 并强烈搅拌。C按下表分别配制不同的培养液，用酸碱调整pH 5.55.8之间储藏液名称完全-NPKCa-Mg-SFe微Ca(NO3)2KH2PO4MgSO47H2OKH2PO4Fe-EDTANaNO3MgCl2Na2SO4CaCl2KCl微量元素1010101011101011010110101012.51101011011010101101101010

15、110110101010101010101101010101用氯化亚铁代替硫酸亚铁2培养和管理 将已培养好的幼苗，选取大小一致的植株，用棉花包裹茎部，插入培养缸盖的孔中，每孔一株。 培养期注意：1pH的调整：pH的激剧改变往往造成实验的失败，因此，从实验开始就职必须注意保持pH在5.56.0之间，假设变动较大可用H2SO4和NaOH进行调整。2经常补充盆内由于蒸发或植物蒸腾造成水分的损失，每隔13天加蒸馏水一次，每隔一周更换一次培养液。3实验前记录幼苗发育状态茎、根、长、叶片大小、颜色等，实验期间随时记录生长发育的情况及病变等，结束时记录植株的鲜重、高度、叶片颜色。必要时测定内部元素的含量。实

16、验六 叶绿体色素的提取、别离和理化性质.提取与别离一、原 理植物叶绿体色素是吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，它一般由叶绿素a；叶绿素b；胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和别离色素认识叶绿体色素的前提。利用叶绿体色素不溶于水而溶于有机溶剂的特性，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。色素别离方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂不断地从纸上流过，由于混合物中各成分在两相即流动相和固定相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，因而使样品混合物别离。二、仪 器 药 品大试管 软木塞大头针 新华滤纸 台天平 漏斗烧杯 量筒研钵 毛细管乙醇 四氯化碳无水硫酸钠 碳酸钙石英砂三、实 验 步 骤

17、1称取新鲜叶子2g放入研钵中加95%乙醇5ml及少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加乙醇5ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。2取准备好滤纸条222cm，将其一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm窄条，见图5。3用毛细管取叶绿素浓缩液点于窄条上端，注意一次所点溶液不可过多，如色素过淡，用电吹风干后再点12次。4在大试管中参加四氯化碳35ml及少许无水硫酸纳。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁。软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。50.51小时后，观察色素带分布。最上端橙黄色胡萝卜素。其次黄色叶黄素，再次蓝绿色叶绿素a

18、，最后是黄绿色叶绿素b。.理化性质一、原 理植物色素包括脂溶性的叶绿体色素和水溶性的细胞液色素，前者如叶绿素与光合作用有关，后者属黄酮类物质，特别与花朵的颜色有关。了解它们的性质有助于对其生理功能的理解。二、仪 器 药 品分光计 天平 乙醚 研钵 漏斗 甲醇 吸球 试管 醋酸 量筒 石英砂 乙醇 醋酸铜 碳酸钙 盐酸 氢氧化铵 氢氧化钾 分液漏斗 一、实 验 步 骤1光对叶绿素的破坏作用 取4支试管，其中2支各参加4ml用水研磨的叶片匀浆，另外2支各参加2ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释一倍。取上述两支试管水研磨的叶片匀浆、色素乙醇提取液各一支，置于强光下，另外两支放到暗处，经23

19、小时后，比照观察溶液的颜色有何变化。解释其原因。2叶绿素的萤光现象 取上述色素提取液少许于试管中，在直射光下观察反射光与透射光溶液的颜色有何不同？解释原因。3H+和Cu2+在叶绿素分子中的替代作用 取上述叶绿素提取液2ml于试管中，一滴一滴参加浓盐酸，摇匀，观察溶液的颜色变化。当溶液出现褐色，此时叶绿素分子已遭破坏，加醋酸铜晶体一小块，渐渐加热溶液，观察记载溶液颜色变化情况，并与提取液颜色相比拟。解释其变化原因。4黄色素和绿色素的别离皂化作用取上述叶绿素乙醇提取液5ml，加到盛有10ml乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘参加20ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分成两层，

20、色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层乙醇和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液一、二次。再在色素乙醚溶液中参加约2ml，30%KOH甲醇溶液，充分摇动分液漏斗，静置约10分钟，然后再参加蒸馏水约10ml及乙醚5ml乙醚可以不加，遥动后静置别离，那么得黄色素层和绿色素层，分别置于试管中保存。5观察色素溶液的吸收光谱 1调节分光计，观察电灯光的光谱。2观察色素丙酮提取液，稀释一倍比拟之。3观察黄色素乙醚溶液，稀释一倍比拟之。4观察皂化叶绿素甲醇溶液，稀释一倍比拟之。5观察被光破坏的色素丙酮溶液。6观察铜取代了镁的色素溶液。【思考题】1研磨提取叶绿素时参加CaCO3有什么作用？ 2试述叶绿体色素的吸收光谱特点及

21、生理意义。3用不含水的有机溶剂无水乙醇、丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？ 实验七 叶绿素a和b含量的测定分光光度法一、原 理叶绿素a、b在长波方面的最大吸收峰分别位于663nm和645nm，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数k为，我们即可以根据Lambert-Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：A663 = 82.04Ca + 9.27Cb1A645 = 16.75Ca + 45.60Cb212式中的D663、D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度。Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度，单位为每升毫克数。82.04、9.27为叶

22、绿素a、b在波长663nm时的比吸收系数。16.75、45.6为叶绿素a、b破波长645nm时的比吸收系数。解方程式12，那么得：Ca = 12.7A6632.69A6453Cb = 22.9A6454.68A6634CT = Ca+ Cb = 20.2A645 + 8.02A6635此时，CT为总叶绿素浓度，单位为每升毫克。利用上面345式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的浓度。Lichtenthaler等对Amon法进行了修正，提出了80%丙酮中三种色素提取液含量的计算公式：Ca=12.21A663-2.81A6466Cb=20.13A646-5.03A6637Cxc=1000A470-

23、3.27Ca-104Cb/2298那么95%乙醇色素提取液中：Ca=13.95A665-6.88A6499Cb=24.96A649-7.32A66510Cxc=1000A47011式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cxc为类胡萝卜素的总浓度；A663、A646、A470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm、470nm下的吸光度。二、仪 器 药 品台天平 剪刀研钵 移液管漏斗 容量瓶分光光度计 石英砂丙酮 碳酸钙三、实 验 步 骤1提取叶绿素取新鲜植物叶片数张剪碎、混匀，于台天平上称取0.2g共三份，置于研钵中，加少许碳酸钙和石英砂及2ml95%乙醇，仔细研磨成匀浆。去滤纸

24、一张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液到入漏斗中，过滤到25ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒、及残渣数次，直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。2测量吸光度 取一光径为1cm的比色杯，注入上述叶绿素乙醇溶液，另以95%乙醇注入同样的比色杯中，作为空白对照，于665nm、649 nm和470m波长下测定吸光度。3计算结果按公式分别计算最后计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度mg/L式相加即得到叶绿素总浓度。叶子样品中叶绿素含量，需要考虑稀释因子，那么得到：叶绿素a含量mg/g鲜重= Ca10.2 【思考题】1叶绿素a、b在红光和蓝光区都有一最大吸收峰，能否用蓝池区的

25、最大吸收峰波长进行叶绿素、a、b的定量分析，为什么？ 实验八 环境因素对光合作用的影响一、原 理利用真空渗透入法排除叶肉细胞间隙的空气，充以水分，使叶片沉于水中。在光合作用过程中，植物吸收CO2放出O2，由于O2在水中的溶解度很小，而在细胞间积累，结果使得原来下沉的叶片上浮，根据上浮所需的时间长短，即能比拟光合作用的强弱。二、仪 器 药 品照度计 温度计钻孔器 注射器小烧杯 40W日光灯冰块实 验 步 骤1从供试植物棉花、蚕豆、蓖麻或油菜等上选取健壮、叶龄相似的成长叶子数片，用直径1 cm左右的钻孔器，避开叶脉，打下小圆片60个，放入大注射器中，注入水，排除空气后，用手指堵住注射器前端小孔，把

26、活塞用力向后拉，即可造成减压而逐出叶肉组织中的空气，放开手指，水即进入组织中，如此重复数次，整个圆片全部充满水分而下沉。把下沉叶圆片连同水倒于小烧杯中，放于黑暗处备用。2取小烧杯6只，其中2只各倒入20ml冷开水，另外4只各加20ml为CO2饱和的冷开水。为方便起见，可用一玻管向冷开水中吹气数分钟，使水中CO2达饱和。然后于6只小烧杯中各放入叶子圆片10个，分别置于不同光强和不同温度条件下，即作如下处理：杯 号光温 度CO21强高CO22强高+ CO23强低+ CO24弱高CO25弱高+ CO26弱低+ CO23记录各杯中每一叶子圆片上浮所需的时间，以一定时间内上浮的圆片数或上浮所需平均时间，

27、比拟各杯的光合作用强弱。4根据结果，试比拟光强、温度、CO2对光合作用的影响。实验九 改进半叶法测大田光合作用强度 一、原 理改进半叶法系将植物对称叶片中的一局部遮光或取下置于暗处，另一局部那么留在光下进行光合作用，过一定时间后，在这两局部叶片的对应部位取同等面积，分别烘干称重，因为对称叶片的两对应部位的等面积的干重原来相等，照光后叶片重量超过暗中的叶重，超过局部即为光合作用产物的产量，并通过一定的计算可得到光合作用强度。二、仪 器 药 品剪刀 分析天平称量皿 烘箱刀片 金属模板纱布 锡纸三氯乙酸 三、实 验 步 骤1选择测定样品在田间选定有代表性植株叶片如叶片在植株上的部位、叶龄、受光条件等

28、20张，用小纸牌编号。2叶子基部处理 为了不使选定叶片中光合作用产物往外运而影响测定结果的准确性，可采用以下方法进行处理：1可将叶子输导系统的韧皮部破坏。如棉花等双子叶植物的叶片可用刀片将叶柄的外皮环割0.5厘米左右宽。2如小麦、水稻等单子叶植物，由于韧破部和木质部难以分开处理，可用刚在开水中浸过的沙布或棉花做成的夹子将叶子基部烫伤一小段即可一般用90以上的开水烫20秒。3由于棉花叶柄木质化程度低，叶柄易被折断。用开水烫，又难以掌握烫伤的程度，往往不是烫得不够便是烫得过重而叶片下垂，改变了叶片的角度。因此可改用化学方法来环割，选用适当浓度的三氯乙酸点涂叶柄以阻止光合产物的输出。三氯乙酸是一种强

29、烈的蛋白质沉淀剂，渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死而起到阻止有机养料运输的作用。三氯乙酸的浓度，视叶柄的幼嫩程度而异以能明显灼伤叶柄而又不影响水分供给、不改变叶片角度为宜。一般使用5%三氯乙酸。为了使烫后或环割等处理后的叶片不致下垂影响叶片的自然生长角度，可用锡纸或塑料管包围之，使叶片保持原来着生角度。3剪取样品叶基部处理完毕后，即可剪取样品，记录时间，开始进行光合作用测定。一般按编号次序分别剪下对称叶片的一半主脉不剪下，按编号顺序夹于湿润的纱布中，贮于暗处。过四、五小时后，再依次剪下别外半叶，同样按编号夹于湿润纱布中，两次剪叶的速度应尽量保持一致，使各叶片经历相等的光照时数。4称重比拟 将各同

30、号叶片之两半按对应部位迭在一起，在无粗叶脉处放上面积如棉花可用1.52cm的金属模板，用刀片沿边切下两个叶块，分别置于照光及暗中的两个称量皿中。在8090下烘至恒重约5小时，在分析天平上稳重比拟。5计算结果 叶片干重差之总和以mg表示除以叶面积换算成dm2,1dm2=100cm2及照光时数，即得光合作用强度，以干物质，mg/dm2h表示之。计算公式如下： 光合作用强度=由于叶内贮存的光合产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘系数1.5，得二氧化碳同化量，单位为CO2, mg/dm2h。实验十 植物呼吸强度的测定小篮子法 一、原 理利用Ba(OH)2溶液吸收呼吸过程中释放的CO2。实验结束后，

31、用浓度草酸溶液滴定剩余的碱液，从空白和样品二者消耗草酸溶液之差，可计算出呼吸过程中释放的CO2量。二、仪 器 药 品500ml广口瓶 温度计100酸式滴定管 枯燥管尼龙窗纱制作的小篮饱和Ba (OH)2 酚酞指示剂：1g酚酞溶于100mL95%乙醇中，储于滴瓶中。1/44mol/L草酸溶液：准确称取重结晶的草酸H2C2O42H2O2.865g溶于蒸馏水中定容至1，000ml。每ml溶液相当于1mlg的CO2。二、实 验 步 骤1安装测试装置 取500ml广口瓶一个，装配一只三孔橡皮塞。一孔插入盛碱石灰的枯燥管吸收空气中的CO2，保证进入呼吸瓶的空气无CO2；一孔插温度计；另一孔直径约1cm左右

32、供滴定用，滴定前用小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一尼龙窗纱制作的小篮，用以盛实验材料，整个装置如图16所示。2称取萌发的小麦或水稻种子2030g，装于尼龙纱小篮内，将小篮挂在广口瓶内，同时加Ba(OH)溶液20ml于广口瓶内，立即塞紧瓶塞，防止漏气。每10分钟左右，轻轻地摇动广口瓶，1小时后，小心翻开瓶塞，迅速取出小篮，参加12滴指示剂，立即重新塞紧瓶塞。然后拔出小橡皮塞，把滴定管插入小孔中，用1/44M的草酸滴定，直到红色刚刚消失为止，记录滴定碱液所耗用的草酸溶液的毫升数。另取500ml广口瓶一只，用沸水煮死的种子至少煮10分钟为材料，按上述步骤进行，以此作为对照。2计算呼吸强度mgCO2/g小时

33、=V0：煮死的种子，滴定时所耗用的草酸溶液的毫升数。V1：发芽种子，滴定时所耗用的草酸溶液的毫升数。【思考题】在实验中，要做到准确测定呼吸强度，应注意那些问题？实验十一 种子生命力的快速测定种子发芽率是指在最适宜条件下，在规定天数内发芽的种子占供试种子的百分数。它是决定种子品质和实用价值大小的主要依据，与播种时的用种量直接有关。但是常规方法直接发芽测定发芽率所需时间较长，特别是有时为了应急需要，没有足够的时间来测定发芽率，遇到休眠种子也无法知道。快速测定法那么能在较短时间内获得结果。. 氯化三苯四氮唑法TTC一、原 理凡有生命活力的种子胚部在呼吸作用过程中都有氧化复原反响，而无生命活力的种胚那

34、么无此反响。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢弹辅酶NADH2或NADPH2上的氢复原时，便由无色的氯化三苯四氮唑TTC变为红色的三苯基甲臢TTF。HH |NNC6H5 | N = NC6H5TTF红色NNNC6H5 | N = NC6H5Cl+2H +TTC无色 C6H5C C6H5C二、仪器 药 品恒温箱 烧杯培养皿 镊子刀片 0.5%TTC溶液称取TTC0.5g放烧杯中，参加少许95%酒精使其溶解，然后用蒸馏水稀释至100ml。溶液避光保存，假设发红时，不能再用。三、实验步骤1浸种将待测种子在3035温水中浸种小麦、大麦、籼谷68小时；玉米5小时左右；粳谷2小时，以增强种胚的

35、呼吸强度，使显色迅速。2显色 取吸胀的种子200粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为二半，将其中的一半置于二只培养皿中，参加适量的0.5%TTC(以覆盖种子为度)，然后置于30恒温箱中0.51小时。结果，凡胚被染为红色的即为具有生命力的种子。将另一半在沸水中煮5分钟杀死种胚，作同样染色处理，作为对照观察。3计算种子活力。. 染料染色法一、原 理凡生活细胞的原生质膜具有选择性吸收能力，而死的种胚细胞原生质膜丧失这种能力，于是染料便能进入死细胞而染色。二、仪 器 药 品培养皿 镊子刀片5%红墨水 三、实 验 步 骤1浸种，同TTC法。2染色取已吸胀的种子200粒，沿胚和中线切为两半，将一半置于培养皿中

36、，参加5%红墨水以淹没种子为度，染色510分钟温度高时时间可短些。染色后，倒去红墨水液，用水冲洗屡次，至冲洗液无色为止。结果凡种胚不着色或色很浅的为生活种子，凡种胚与胚乳着色程度相同的为死种子。可用沸水杀死的种子作对照观察。3计数种胚不着色或着色浅的种子数，算出种子活力。【思考题】种子生命力和种子发芽率有区别吗？为什么？实验十二 过氧化物酶活性的测定过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化酶的作用，掌握常用的测定过氧化

37、物酶的方法愈创木酚法。一、原 理在过氧化物酶(peroxidase)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。二、仪 器 药 品材料马铃薯块茎。、仪器设备722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。、试剂10.05 mol/L、pH5.5的磷酸缓冲液。20.05 mol/L愈创木酚溶液32%H2O2。三、实 验 步 骤1酶液的制备 取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3 000g离心10min，上清液转入25mL容量

38、瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。2过氧化物酶活性测定酶活性测定的反响体系包括：2.9mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液；1.0 mL 2% H2O2；1.0mL 0.05 mol/L愈创木酚 和0.1mL 酶液。用加热煮沸5 min 的酶液为对照，反响体系参加酶液后，立即于34水浴中保温3 min，然后迅速稀释1倍，470nm波长下比色，每隔1 min记录1次吸光度，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位u。结 果 计 算以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位u。过氧化物酶活性式中：A470为反响

39、时间内吸光度的变化；W为马铃薯鲜重，g；t为反响时间，min；VT为提取酶液总体积，mL；VS为测定时取用酶液体积，mL。【思考题】1简述测定过氧化物酶活性的生理意义。2本测定方法有哪些需要改进的地方。实验十三 氮蓝四唑NBT法测定 超氧物歧化酶SOD活力一、原 理超氧物歧化酶superoxide dismutase, SOD普遍存在于动、植物体内，是一种去除超氧化阴离子自由基O的酶，它催化以下反响：2O+ 2H+ H2O2 + O2反响产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑NBT在光下的复原作用来确定酶活性大小，在有氧化物质存在下，核黄素可

40、被光复原，被复原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O，O可将氮蓝四唑复原为蓝色甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可去除O，从而抑制子甲腙的形成。于是光复原反响后，反响液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂、材料水稻或小麦叶片。 、仪器设备 高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯反响试管处照度为4000 lx，试管或指形管数支。、试剂10.05 mol/L 磷酸缓冲液pH 7.8。2130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。3750mol/L氮蓝四唑溶液：称0.061

41、33 g NBT 用磷酸缓冲定容至100mL, 避光保存。4100mol/L EDTA-Na2 溶液：称取0.03721 g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1 000mL。520mol/L核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1 000mL避光保存。三、实 验 步 骤1酶液提取取一定部位的植物叶片视需要定，去叶泳0.5 g于预冷的研钵中，加1 mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5 mL。取1.52 mL于1 000 r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2显色反响取5 mL指形管要求透明度好4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表2-24

42、-1参加各溶液：表2-24-1 各溶液显色反响用量试 剂酶用量/mL终浓度/比色时0.05 mol/L磷酸缓冲液1.5130 mmol/L Met 溶液0.313 mmol/L750 mol/L NBT溶液0.375mol/L100 mol/L EDTA-Na2液0.310mol/L20 mol/L 核黄素0.32.0mol/L酶 液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4 000 lx 日光下反响20 min要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长。3SOD活性测定与计算至反响结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的

43、吸光度。SOD活性单位以抑制NBT光化复原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积，mL；Vt为测定时样品用量，mL；W为样鲜重，g；蛋白质含量位为mg/g。【思考题】1在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管？2影响本实验准确性的因素是什么？应如何克服？实验十四 脯氨酸含量的测定在逆境条件下旱、盐碱、热、冷、冻，植物体内脯氨酸proline, Pro的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多

44、的脯氨酸，因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。一、原 理当用基磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，那么色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即表示脯氨酸含量的上下。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出或用回归方程计算脯氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂、材料待测植物水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等叶片。、仪器

45、设备722型分光光度计，研钵，小烧杯，容量瓶，大试管，普通试管，移液管，注射器，水浴锅，漏斗，漏斗架，滤纸，剪刀。、试剂 1酸性茚三酮溶液：将1.25 g 茚三酮溶于30 mL 冰醋酸和20mL 6 mol/L磷酸中，搅拌加热70溶解，贮于冰箱中。 23%磺基水杨酸：3g 磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100 mL. 3冰醋酸。 4甲苯。三、实 验 步 骤1标准曲线的绘制1在分析天平上精确称取25 mg 脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100g。2系列脯氨酸浓度的配制。取6个50 mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液

46、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 及3.0mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1g/mL、2g/mL、3g/mL、4g/mL、5g/mL及6g/mL。3取6支试管，分别吸取2 mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。4冷却后各试管准确参加4 mL 甲苯，振荡30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。5用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。6标准曲线的绘制：先求出吸光度值y依脯氨酸浓度x而变的回归方程式，再按回归方程式绘

47、制标准曲线，计算2mL测定液中脯氨静酸的含量g/mL。2样品的测定1脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5 g，分别置入大试管中，然后向各管分别参加5mL 3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min提取过程中要经常摇动，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。2吸取2 mL 提取液于另一干净的带玻塞试管中，参加2 mL 冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。3冷却后参加4 mL甲苯，摇荡 30 s，静置片刻，取上层液至10 mL离心管中，在3 000 r/min 下离心5 min。4用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以

48、甲苯为空白对照，在分光光度计上520 nm波长处比色，求得吸光度值。结 果 计 算根据回归方程计算出或从标准曲线上查出2 mL 测定液中脯氨酸的浓度xg/mL，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下；单位鲜重样品的脯氨酸含量【思考题】比拟干旱、低温和正常生长条件下的植物体内脯氨酸的含量。测定脯氨酸含量有何意义。实验十五 植物组织中丙二醛含量的测定一、原 理植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(malondialdehyde, MDA) 是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜指过氧化程度和植物对逆境地条件反响的强弱。 MDA在高温、酸性条件下与硫

49、代巴比妥酸TBA反响，形成在532 nm 波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数这155mmol/(Lcm)，并且在600 nm 波长处有最小光吸收。可公式A532A600 = 155 000CL 1算出MDA浓度Cmol/L，进一步算出单位重量鲜组织中MDA含量Cmol/L。式中A532和A600分别表示532 nm 和600nm波长处的吸光度值。L为比色杯厚度cm.需要指出的是，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反响有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用以下公式消除由蔗糖引起的误差。C/g/Ml/L=6.45(A523A600)0.56A450 2式中A450、A532

50、、A600分别代表450 nm、532 nm 和 600 nm波长下的吸光度值。用公式2可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度，进一步算出其在植物组织中的含量。二、材料、仪器设备及试剂、材料植物根或叶。、仪器设备研钵，试管，可调加样器，恒温水浴锅，冷冻离心机，分光光度计。、试剂15%三氯乙酸TCA。20.67%硫代巴比妥酸TBA。三、实 验 步 骤1取0.5 g 植物样品叶、根，加5%TCA 5 mL，研磨后所得匀浆在3 000 r/min下离心10 min。2取上清液2 mL，加0.67%TBA 2 mL，混合后在100水浴上煮沸 30 min，冷却后再离心一次。3分别测定上清液在450 n

51、m、532 nm 和600 nm处的吸光度值，并按公式2算出MDA浓度，再算出单位鲜量组织中的MDA含量mol/g。【思考题】1第二次离心起什么作用？2哪些因素会影响MDA含量测定结果？实验十六 植物抗逆性的测定电导仪法一、原 理植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞漠遭到破坏，膜透性增在，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关，这样，比拟不同作物或同一作物不同品种在相同胁迫温度下膜透性的

52、增大程度，即可比拟作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。二、材料、仪器设备及试剂、材料小麦、女贞叶片。、仪器设备电导仪，天平，温箱，真空枯燥器，抽气机，恒温水浴锅，注射器。、试剂NaCl 溶液。三、实 验 步 骤1制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0.10g/mL、20g/mL、40g/mL、60g/mL、80g/mL、100g/mL的标准液，在2025恒温下用电导仪测定，可读出电导率。2选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子假设干，剪下后，先用纱布拭净，称取两份，各重2 g。3一份插入小杯

53、中放在40恒温箱内萎蔫0.51h，另一份插入水杯中中在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗两次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中大小以能够容纳电极为度，并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确参加蒸馏水20mL，浸没叶片。4放入真空枯燥器，用抽气相抽气78 min以抽出细胞间隙中的空气。重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶下沉。5将抽过气的小玻杯取出，放在实验桌上静置20 min，然后用玻棒轻轻搅动叶片，在2025恒温下，用电导仪测定溶液电导率。6测过电导率之后，再放入100沸水浴中15 min，以杀死植物组织，取出放入自来水冷却10 min，在2025恒温下测其煮沸电导率

54、。实验结果及分析伤害率可以用以下三种形式表示：1伤害率2伤害率3伤害率试比拟不同处理萎蔫处理与对照的叶片细胞透性的变化情况，记录结果，并加解释。注 意 事 项1整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净全部器皿要洗净，也不要用手直接接触叶片，以免污染。2各处理和对照的待测液的体积要一样。3测定后电极要清洗干净。【思考题】植物抗逆性与细胞膜透性有何关系？用电导仪法定量测定细胞透性变化为作么要用纯NaCl做标准曲线？附 录附表 1 常用缓冲液的配制1柠檬酸缓冲溶液贮备液A：0.1M柠檬酸溶液19.21gC6H8O7配成1,000ml。贮备液B：0.1M柠檬酸钠29.41gC6H5O7Na32H2O配成

55、1,000ml.Xml A+yml B，稀释成100mlpHxypHxy3.046.5 3.54.823.027.03.243.7 6.35.020.529.53.440.010.05.218.032.03.637.013.05.416.034.03.835.015.05.613.736.34.038.017.05.811.838.24.231.518.56.09.540.54.428.022.06.27.242.84.625.524.52磷酸缓冲溶液贮备液A：0.2M NaH2PO4溶液27.8g NaH2PO4H2O配成1,000ml。贮备液B：0.2M Na2HPO4溶液53.65Na2

56、HPO47H2O或71.7g Na2HPO412H2O 配成1,000ml。xmlA+ymlB,稀释至200ml.pHxypHxy5.793.56.56.945.055.05.892.08.07.039.061.05.990.010.07.133.067.06.087.712.37.228.072.06.185.015.07.323.077.06.281.518.57.419.081.06.377.522.57.516.084.06.473.526.57.613.087.06.568.531.57.710.589.56.662.5 37.57.88.591.56.756.543.57.97.093.06.851.049.08.05.394.73醋酸缓冲溶液贮备