专题1基因工程

1、专题1基因工程限制性核酸内切酶“分子剪刀” DNA连接酶“分子缝合针” 目的基因进入受体细胞的载体“分子运输车” 一、基因工程的工具（一）限制性核酸内切酶“分子剪刀”分布：作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列。切点：磷酸二酯键结果：使DNA分子断开，产生黏性末端或平末端。限制酶（一）限制性核酸内切酶“分子剪刀”区分：黏性末端和平末端限制酶的识别特点:以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列（回文结构）（二）DNA连接酶“分子缝合针”DNA连接酶:将DNA双链片段之间的缺口连接起来，形成磷酸二酯键的酶。连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌

2、体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。Ecoli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。（二）DNA连接酶“分子缝合针”载体必须具备的条件： 1、能够在宿主细胞中稳定地保存并复制； 2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、荧光蛋白基因等 ） 4、对受体细胞无害载体的作用： 1、将外源基因转移到受体细胞中去。 2、使目的基因在受体细胞内，进行复制，表达。常用的载体有：质粒， 噬菌体的衍生物，动植物病毒（如逆转录病毒）等（三）基

3、因的运载体“分子运输车”质粒 质粒是基因工程最常用的运载体，存在于细菌、酵母菌、放线菌等微生物中，是能够自主复制的小型环状双链DNA分子，控制细菌的耐药性（抗药性）、毒素等，编码细菌生命非必须的性状。一般要对天然质粒进行人工改造获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因检测与鉴定第一步第二步第三步第四步二、基因工程的基本步骤基因工程的核心（一）、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子2、获取方法：(1)从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）(2)利用PCR技术扩增目的基因（变性，退火，延伸）(3)通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成

4、如：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性较强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.零件及其作用（1）目的基因:人类研究的，为得到所需蛋白质产物或性状而获取的基因（二）、基因表达载体的构建复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因（2）启动子：一段有特殊结构的DNA片段，

5、位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。（3）终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。1.构建目的（4）标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA（1）.用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）.用_切断目的基因，使其产生_。（3）.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶切口DNA连接酶相同的黏性末端3、过程：问：限制酶Mun 和限制酶EcoR 的识别序列及切割位点分别是CAAT

6、TG和GAATTC。如右图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因运载体的质粒是 练习A （3）基因工程中常用的受体细胞有原核的：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等;真核的：酵母菌、植物细胞、动物受精卵等。 （三）、目的基因导入受体细胞 （2）导入受体细胞的方法 主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。 （1）将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。1.基础知识：真核受体：优点：可表达真核基因组DNA，可适当修饰表达的蛋白质产物。缺点：操作技术难、费时、费钱原核受体：优点：繁殖速度

7、快，遗传物质性对少。缺点：不宜表达真核基因组DNA；不能加工真核蛋白质。.农杆菌转化法一般用于双子叶植物和裸子植物（1）导入植物细胞.其他方法（见教材P12、13）A:基因枪法B:花粉管通道法2.导入方法：显微注射技术含目的基因的表达载体动 物 的受 精 卵含目的基因的受精卵早 期胚 胎雌性动物输卵管或子宫转基因动 物显微注射分裂分化移 植发育问题为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？（2）导入动物细胞. 过程制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合在特定温度下，完成转化。Ca2+ 处理法（3）导入微生

8、物. CaCl2的作用增大细菌细胞壁的通透性（四）、目的基因的检测与鉴定常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。1.分子水平常用分子杂交法分子杂交：采用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测样品中未知核酸分子或蛋白质分子。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可以在蛋白质与蛋白质之间进行。 核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。蛋白质之间的杂交通过抗原抗体反应进行。通常通过各种方法将核酸（蛋白质）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等标记的探针（抗体）与被固定的分子杂交

9、，经显影（显色）后显示出目的核酸（蛋白质）分子。 如：DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 探针：是一小段带标记的单链DNA或者RNA片段用于检测与其互补的核酸序列。1.Southern杂交用于分析DNA 2.Northern杂交用于分析RNA 3.Western杂交用于分析蛋白质 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，采用DNA分子杂交技术。检测目的基因是否转录出了mRNA，分子杂交技术。检测目的基因是否

10、翻译出了蛋白质，采用抗原抗体杂交技术。分为：正向Northern杂交是将待测RNA固定在纤维膜上,用特异序列DNA探针与其杂交,再显影观察和反向Northern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上,用待测RNA做成探针与其杂交,再显影观察. 分为：抗原法,夹心法,竞争法a.抗原法是将待测抗原固定在膜上,加特异抗体与其结合,洗膜,显色,观察b.夹心法是将一抗固定在膜上,加待测抗原,洗膜,加特异二抗,洗膜,显色,观察c.竞争法是分对照和试验两组,对照组将特异抗原固定在膜上,实验组将待测抗原固定在膜上,都加入特异抗体,显色,观察.用于比较抗原的特异性. 1.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交适合于核酸样品的

11、定性检测，而不是定量检测。2.原位杂交菌落、噬菌斑以及真核细胞原位杂交。 原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。 其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体(Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。 30基因芯片的测序原理是通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。先在一块基

12、片表面固定序列已知的核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的靶核酸序列，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列请分析溶液中靶序列为(图2)AAGCCTAGCTGAA BTCGGATCGACTT CATCGACTT DTAGCTGAAATATGCAATCTAG（后图）例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。2.个体水平抗虫鉴定、抗病鉴定等谢谢！基因文库定义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群

13、体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)组成：外源DNA片段、载体和宿主细胞(1)从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.如：cDNA文库分类. 基因文库的构建A:基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许 多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）B:cDNA文库的构建mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶HRN

14、A降解单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶剪切一定大小的DNA片段将DNA片段与运载体连接导入受体菌中储存基因组文库A:基因组文库的构建（直接分离法、鸟枪法）. 基因文库的构建目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA+单链DNA)单链cDNA反(逆)转录酶双链cDNA(目的基因)B:cDNA文库的构建（反转录法）. 基因文库的构建核酸酶HDNA聚合酶导入受体菌中储存cDNA文库IMN基因组DNA文库与cDNA文库的比较(2)利用PCR技术扩增目的基因 概念：PCR全称为_，是在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、_ _、

15、 _、 _ 、 Mg2+等 前提条件： 。原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为循环次数）结果：多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列dNTP引物(dna成分)热稳定DNA聚合酶（Taq酶）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增双链的解开(2)利用PCR技术扩增目的基因温度控制过程：a、高温变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、低温退火（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。 c、中温延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链高温变性90-

16、95C中温延伸70-75C退火（低温）复性55-60C循环蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成(3)通过DNA合成仪人工合成目的基因适用范围：当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。DNA合成仪色氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸赖氨酸由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列过程 直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌、变性等处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有目的序列的菌落。补充：菌落原位杂交法Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶15CGATCC GGCCTA

17、G+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组DNA载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接补充：黏性末端连接不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点Bg l切割位点+EcoR+ Bg l双酶切Eco R+ Bg l双酶切T4 DNA连接酶15C重组体目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连补充：平末端连接cDNA文库 (cDNA library) 提取某生物组织或发育时期的总mRNA，经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。cDNA文库的主要优点cDNA文库特别适