刃天青还原法在鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌多黏菌素B体外药物敏感性快速检测中的应用

1、刃天青还原法在鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌多黏菌素B外药物敏感性快速检测中的应用吴兴龙;赵翔文; 赵庆玲【期刊名称】检验医学年(卷),期】2019(034)009【总页数】3页(P812-814)【关键词】刃天青还原法;体外药物敏感性试验;快速检测;多黏菌素B作 者】 吴兴龙; 赵翔文;赵庆玲 【作者单位】 山东省兰陵县人民医院检验科山东兰陵 277799; 山东省荣军总医院检验科山东济南 250013正文语种】 中文中图分类】 R446.1鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌都是医院感染的重要病原菌，两者多重耐药菌株的出 现给临床抗感染治疗带来极大困难1。多黏菌素B类抗菌药物被认为是治疗这2 种耐药菌株

2、感染的最后一道防线2-3，然而随着多黏菌素B使用频率及剂量的增 加，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌对多黏菌素 B 的耐药率也在逐渐上升4。因此， 快速获得多黏菌素B的药物敏感性试验结果对于控制鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞 菌感染尤为重要。目前，检测革兰阴性菌药物敏感性的常规方法是通过肉汤稀释法 测定药物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC )，但该方法耗时长，临床实验室很难在24 h内获得结果。近年来，基于氧化-还原反应的的刃天青还原法被用于体外药物敏感性试验，具有快速、敏感的特点，目前关于 该方法在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌药物敏感性检测中的应用报

3、道较少。本研究 以传统的肉汤稀释法作为金标准，评价刃天青还原法的检测效能，以确定该方法应 用于鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌多黏菌素B药物敏感性试验的可行性。1材料和方法菌株 收集2018年分离自山东省兰陵县人民医院各类临床样本的鲍曼不动杆菌53株和 铜绿假单胞菌59株。所有菌株均经VITEK-2 compact全自动微生物分析系统(法国生物梅里埃公司)鉴定确认。-80 C保存。试剂M H培养基(英国OX IOD公司)，多黏菌素B上海麦克林生化科技有限公司， 含药培养基为含4.17 mg/L多黏菌素B的MH培养基，在试验中需与菌悬液混匀 孵育( 180:20,V/V),其多黏菌素B的终浓度为3.7

4、5 mg/L。刃天青购自上 海生工生物试剂有限公司，用灭菌去离子水配成1.6 mg/mL的母液，使用前稀释 成0.013 mg/mL的刃天青显色剂。肉汤稀释法体外药物敏感性试验采用美国临床实验室标准化委员会(the Clinical and Laboratory Standards Institute , CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测定保存菌株对多黏菌素B的MIC值。 判定标准为：MICS2 mg/L,敏感；MIC2 mg/L，耐药。每个实验重复3次， 如重复实验的结果有显著差异时，则取中位值进行判定。刃天青还原法体外药物敏感性试验刃天青还原法体外药物敏感性试验在NORDMANN等5使用的

5、方法的基础上进 行了改进。用MH培养基将每种待测菌株和对照菌株的菌悬液稀释至浓度为9x108 CFU/mL（菌悬液的终浓度约为9x107 CFU/mL）。在96孔板的第1列 中加入180 pL MH培养液，记为A1、B1、C1、D1;第2列中加入180 pL含药 MH培养液，记为A2、B2、C2、D2。分别在A1和A2孔中加入20 pL 0.85%氯 化钠溶液（空白对照）；在B1和B2孔中加入20 pL多黏菌素B敏感菌菌悬液 （阴性对照）；在C1和C2孔中加入20 pL多黏菌素B耐药菌菌悬液（阳性对 照）；在D1和D2孔中加入20 pL待测菌菌悬液。用移液枪吸打混匀。同时检测 多个菌株时，操作

6、控制在15 min内完成。微孔板在（352）C环境下孵育，不 密封，不搅拌。孵育3 h后，每孔加入22 pL刃天青溶液，用移液枪吸打混匀。经过前期加刃天青指示剂后不同时间记录颜色变化条件的筛选，选定在添加刃天青 指示剂后60 min，记录各微孔颜色变化。结果判读：在添加刃天青指示剂后60 min，各微孔的颜色变化见图1。（1）阴性 对照。在空白对照的微孔中，因无菌株增殖，刃天青未被还原，仍显刃天青的蓝色； （2 ）阳性对照。在不含多黏菌素B的MH培养基对照微孔中，因菌株增殖导致刃 天青被还原为试卤灵，颜色由蓝色变为粉红色或紫色；（3）阴性。在含多黏菌素 B的微孔中，若菌株增殖被抑制，刃天青未被

7、还原，仍显刃天青的蓝色，则判定为 阴性（敏感）；（4）阳性。在含多黏菌素B的微孔中，若菌株增殖导致刃天青被 还原为试卤灵，颜色由蓝色变为粉红色或紫色，则判定为阳性（耐药）。因此，对 于待测菌株，当颜色为粉红色或紫色时，可判定为阳性，即多黏菌素 B 耐药菌株； 显蓝色，可判定为阴性，即多黏菌素B敏感菌株。图1刃天青指示剂在药物敏感性试验中的颜色变化注：（a）为经过3 h的孵育， 在未添加刃天青指示剂前，所有孔均为微黄色；（b）为添加刃天青指示剂后，所 有孔显刃天青的蓝色；（c）为添加刃天青指示剂后60 min ,空白对照因不含菌 悬液，颜色不变；不含多黏菌素B的MH培养基，因菌株增殖，刃天青被还

8、原为 试卤灵，显粉红色或紫色；阴性对照的含药培养基，因菌株增殖被抑制，颜色仍显 蓝色；1为MH培养基；2为含药培养基2 结果肉汤稀释法体外药物敏感性试验结果肉汤稀释法体外药物敏感性试验结果显示：53株鲍曼不动杆菌中，有18株MIC 2 mg/L，耐药率为33.96% ; 59株铜绿假单胞菌中，有15株MIC2 mg/L , 耐药率为25.42%。刃天青还原法体外药物敏感性试验结果 33株肉汤稀释法试验耐药的菌株均被刃天青还原法检出；79株肉汤稀释法非阴性 的敏感菌株中，有1株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌被刃天青还原法检测为 阳性，其他菌株药物敏感性试验结果与肉汤稀释法结果一致。以肉汤稀释法为

9、标准， 刃天青还原法的阳性检出率为100%（33/33） ，准确性为98.2%（110/112）。 所有阳性结果均在加入刃天青显色剂后60 min内被鉴定。3 讨论碳青霉烯类耐药菌株鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌感染是导致患者发病和死亡的重 要原因之一6。世界卫生组织和美国疾病预防控制中心均将碳青霉烯类耐药菌株 鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌列为严重病原体7。多黏菌素B类抗菌药物被认为 是治疗碳青霉烯类耐药菌株鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌感染的最后一道防线2- 3。目前，检测革兰阴性菌药物敏感性的常规方法是通过肉汤稀释法或微量肉体稀释法 测定MIC。但该方法耗时长，且准确性受到药物种类与剂量、容器对药物

10、吸附等 多种因素的影响。虽然E-test法或纸片扩散法均可检测碳青霉烯类耐药菌株鲍曼 不动杆菌和铜绿假单胞菌的药物敏感性，但假阴性率偏高（32%）8-9。刃天青还原法的基本原理是活性细胞可将蓝色的刃天青还原为粉红色的间苯二酚产 物试卤灵，且反应量与活性细胞数量呈正相关9。因此，可将微生物在添加药物 和刃天青的培养基中培养一段时间，通过观察培养基颜色变化来确定微生物的增殖 情况，即受药物抑制程度10。刃天青还原法已被用于临床结核分枝杆菌5和部 分真菌的药物敏感性评价，但对刃天青还原法用于铜绿假单胞菌药物敏感性试验的 报道还很少。本研究结果显示，采用刃天青还原法对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌进行多黏

11、菌素B的药物敏感性定性试验的结果与肉汤稀释法基本一致（阳性检出率为100%，准 确性为 98.2%），与采用刃天青还原法检测大肠埃希菌药物敏感性的结果一致 6 刃天青还原法仅能给出体外药物敏感性试验的定性结果，但该方法耗时短，与金标 准方法的一致性好，对于指导临床合理使用抗菌药物仍具有重要意义。且该方法操 作简便、成本低，值得在临床检验中推广。参考文献【相关文献】汪复多重耐药铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌严重感染的防治策略J.中国感染与化疗杂志， 2007，7(3)：230-232.袁莹，杨颖.多粘菌素BB和E :如何选择J.中国感染控制杂志，2017，16 (7 ): 677-682.VELKO

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