检测方法验证和确认程序

1、内部文件标题：SOP-QC-025-00检测方法验证和确认程序培训讲义目的 PURPOSE本规程规定了XXXXXXX药业有限公司检测方法验证和确认程序、格式和要求。范围 SCOPE本规程适用于XXXXXXXX药业有限公司QC实验室的检测方法的确认。本规程适用于美国药典/国家处方集、欧洲药典或其它药典中记载的检测方法，和来自于公司内部或外部的已经验证的检测方法。本规程注重在鉴别、纯度和含量的检测方法。本规程将作为2.3提及的检测方法验证的常规指引，也适用于最常用的检测方法的验证，如：鉴别测试有关物质和降解产物的含量的定量测试。控制有关物质和降解产物的限度测试。原料药、起始物料、中间体及其他物料的

2、含量测定。微生物和生物检测方法不在本规程范围内。参考 REFERENCEICH Q2(R1)分析方法验证的文本及方法学现行美国药典药典方法的验证现行美国药典药典方法的确认ICHQ7原料药的良好质量管理规范（2000年11月）FDA行业指南“分析方法和方法验证”（2000年8月）职责 RESPONSIBILITIESQC负责人或指定人员负责参与本规程的起草、审阅、修订和更新。QA负责人或指定人员负责本规程的审核和保证其被正确地、准确地执行。QC负责市售产品的检测方法验证，确认这些方法在实际条件下适用于本实验室的测试。QC负责人或指定人员负责审核确认方案和确认报告QC负责正确地记录实验数据。QC负

3、责归纳数据、撰写报告并递交给QC负责人或指定人员审阅。QC、QA负责人或其指定人员负责审核并审计所有实验室相关文件及规程以确保其准确和有效。质量部负责批准本规程及验证、确认方案和验证、确认报告。定义 DEFINITION检测方法使用者使用检测方法的部门、实验室或人员。系统适用性它是用来验证系统能满足预期分析的测试。当适用时，系统适用性应在方法用于检测或分析样品之前执行。指定的数据，比如响应值和保留时间的相对标准偏差（RSD）、拖尾因子、分离度和理论塔板等，将从重复进样得到。检测方法指进行检测的方式，应详细描述进行每个检测实验所必需的步骤。它可以包括：试剂、对照品及样品溶液的配制，仪器的参数、标

4、准曲线的绘制、计算公式的运用、可接受标准等。检测方法验证为了证明所使用的检测方法（新的或改进过的）与其预期目的相适应而进行的一系列实验。对照品和样品溶液稳定性用来评价对照品和供试品的稳定性而进行的检测。原料药任何用于药品生产的物质或混合物，并在药品生产的过程中成为药物的活性成分。这类物质提供药物活性或其他的直接效应应用于诊断、治疗、缓和、处理或预防疾病、或影响身体的机结构或功能。鉴别测试鉴别试验旨在确认样品中的一种被测物的特性。通常将样品的性质（如光谱、色谱行为、化学反应等）与参比对照品的性质进行比对。杂质检查指样品中杂货的定量检测或限度检测，两种检测均是为了准确反映样品的纯度。定量试验所需验

5、证的项目与限度试验相比是不同的。含量测定指测定样品中被分析物的含量。专属性指在可能存在某些干扰组分（如杂质、降解物、基质等）时，对被分析物准确可靠测定的能力。精密度指在规定条件下对均质样品多次取样进行一系列检测，检测结果的接近程度（离散程度）。重复性指在同样的操作条件下，较短时间间隔内的精密度。中间精密度指实验室内部条件改变，如：不同日期、不同分析者、不同仪器等情况下的精密度。重现性指不同实验室之间的精密度（合作研究，通常用于方法学的标准化）。检测限（LOD）指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，但不必要准确定量。定量限（LOQ）指在适当的准确性和精密度下，能够定量测定的样品中被分析物的最低

6、量。线性指在给定的范围内检测结果与样品中被分析物的浓度（量）成比例关系的能力。准确度指真实值或认可的参考值与测量值之间的相近程度。准确度有时也称真实度。范围指样品中被分析物的浓度（量）上限和浓度（量）下限之间的一个区间，并已证实在此区间内，该检测方法具有适当的精密度、准确性和线性。耐用性指在实验参数被故意地发生细小改变时，检测不受影响的能力，用以说明所验证的方法在正常使用时的可靠性。加标向标准品、样品或空白剂中加入已知量的已知物质，用于确定检测方法的性能或进行仪器的校验。响应因子分析物产生的信号与产生该信号的分析物的量的比值。可接受标准测试结果可接受的数值限度、范围或其它合适的度量标准。相关系

7、数（R）研究变量之间 HYPERLINK /wiki/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3 o 线性相关 线性相关程度的量。信噪比（S/N）纠正与预防措施（CAPA）程序 RROCEDURE检测方法使用者应该经过培训，具有相应的经验和知识，以理解检测方法并能够执行它。确认应当由使用者执行，其结果将为检测方法能像预期的那样地执行增加信心。检测方法确认和验证的目的是说明该方法适用于其拟定用途，它包括试验过程中计划的、系统的和记录的数据，以证明方法能满足其拟定分析用途的要求。于药典检测方法，如果确认不成功，并且经药典人员的协助也未能解决问题，则可断定此方法不适合在

8、该实验室用于该样品。然后，可能有必要按照药典或相关法规开发和验证一个替代的方法。确认的要求应该基于方法的复杂性和应用此法的物质的复杂性两方面来进行的评估。只有那些适合特定方法的确认特性才需要做评估。确认程序的程度与层次取决于使用者的培训经历及经验水平、方法种类和与其相关的设备/仪器、具体的方法步骤、和/或被测的物质。除非有迹象表明基本药典方法不适合检测该样品，日常执行的基本药典检测方法无需确认。基本药典检测方法的例子包括但不限于，干燥失重、炽灼残渣、多种湿化学方法比如酸度、简单仪器方法比如pH值测定等。检测方法验证的进行程度应能反映检测的目的和生产工艺所处的阶段。非药典检测方法的建立和现行方法

9、的改变必须进行验证。SOP-QC-025/A01显示了检测方法验证的流程。在检测临床试验批次的样品时，虽然检测方法可能尚未验证，但检测方法须具有科学性。并应显示检测方法的适用性。应提供验证结果的表格概要（例如：专属性、线性、范围、准确度、精密度、LOD和LOQ的结果或数值）。此时不需要提供完整的验证报告，可在放行检测同时进行分析方法验证。检测方法确认和验证方案在确认或验证工作开展前需有已经批准的确认或验证方案。方案内容应包括但不限于下列项目：目的 PURPOSE应包括：背景介绍和方法描述。范围 SCOPE参考 REFERENE职责 RESPONSIBILITIES定义 DEFINITION方法

10、学METHODOLOGY程序部分应列出确认特性。偏差 DEVIATION附件 ATTACHMENTS修订历史 DOCUMENT REVISE HISTORY确认和验证中所有的原始记录和得到的结果必须记录在执行方案或已编号的检测记录本上，以方便与其它文件的相互查询。确认和验证过程中若有偏差，需按偏差处理相关规程和调查方法相关规程执行。检测方法根据变化需决定是否要进行再次验证，再次验证也需依据本SOP执行，包括方案和报告的批准。下列变化情况需进行再次验证：相关指南变化，例如：ICH或药典原料药的合成工艺变化检测方法和/或设备变化检测方法确认和验证报告Test Method Validation a

11、nd verification Report确认和验证方案完成后必须准备相应的方法确认和验证报告，并由质量部批准生效。推荐的方法验证报告中可以包括下列内容：总结 SUMMARY OF RESULTS目的 PURPOSE范围 SCOPE物料和设备 MATERIAL ANDEQUIPMENT方法METHOD结果和讨论RESULTSAND DISCUSSIONS结果部分应包括验证项目、可接受标准和结果等。偏差 DEVIATION任何偏差均应进行调查和报告。结论 CONCLUSTION建议 RECOMMENDATIONS参考 REFERENCE附件 ATTACHMENTS可以包括所有参与人员的资格或培

12、训记录、仪器校验证书、试剂检验报告单、实验记录，原始数据、图谱和结果的一览表等。修订历史 DOCUMENT REVISE HISTORY检验方法确认需确认的特性通常所要求的确认特性包括但不限于下表中提及的。表1：进行检测方法确认要求确认的特性特性Characteristics分析方法的类型Type of analytical procedures鉴别Identification杂质检测Testing for impurities含量分析Assay定量检测Quantitative test限度检测Limit test含量/效价Content/Potency准确度Accuracy-专属性Speci

13、ficity +-重复性Repeatability-+中间精密度Intermediate precision-+-+检测限LOD+-+-定量限LOQ-系统适用性System suitability-注：-表明通常不需评估的特性+表明通常需评估的特性缺乏该项目的分析方法，应由其他分析方法来补充表明有些情况下需要检测方法验证需验证的特性验证的程度取决于相应的验证方案中规定的检测的性质及其用途。检测方法验证常用的验证特性包括但不限于表2内容。表2：检测方法验证所需的验证特性特性Characteristics检测方法类型Type of test methods鉴别Identification有关物质和

14、降解物测试Testing for related compounds and degradants含量（仅限测试）Assay (measurement only)定量测试Quantitative test限度测试Limit tests专属性Specificity+线性Linearity-+-+范围Range-+-+准确度Accuracy-+-+精密度Precision重复性Repeatability-+-+中间精密度Intermediate precision-+-+重现性Reproducibility-检测限LOD-+-定量限LOQ-+-耐用性Robustness-+-+系统适用性（如有）S

15、ystems Suitability (if any)+注：-表示该特性通常不需评估+表示该特性通常需评估当一种检测方法不能满足专属性的要求时，可由其他辅助检测方法作补充。如果已经评价了重现性，就不需要再评价中间精密度。基于检测的性质可能需要。依据所研究方法的类型，在开发阶段考虑评估耐用性。下述6.86.17对具体验证特性进行逐个描述，以对每一种检测方法的各种验证特性提供指导和/或建议。专属性用于证明专属性的方式取决与检测方法的预期目的。一般一种检测方法不太可能对某一特定的被分析物具有专属性（完全辨别）。在这种情况下，推荐使用两种或多种检测方法的组合以达到所需的辨别程度。鉴别的专属性试验合适的

16、鉴别测试应能区别出可能存在的结构相似的化合物。通过对从含有被分析物的样品中得到的正结果（可以通过与已知参比物比较），和对不含被分析物的样品中得到的负结果来证明方法的分辨能力。对与分析物结构相似或相近的物质进行鉴别试验，证明没有得到正响应。含量和杂质检查的专属性试验可获得的有关物质和降解物对含量测定来说，专属性应能辨别被分析物与有关物质和降解产物。实际操作中可以在纯物质中加入适当量的有关物质和降解物，与未加有关物质和降解物的样品测定结果相比较，以证明其含量测定结果不受这些物质的影响。对有关物质测试，可以向原料药中加入含有适当量的有关物质，通过证明这些有关物质之间能相互分离，并也能与样品基质中其他

17、组分分离，以此来证明测试方法的辨别能力。无法获得的有关物质和降解物如果有关物质或降解物的对照品不能得到，专属性可以通过将含一定量的有关物质或降解产物的样品测定结果与另一种成熟的方法测定结果比较，例如与药典方法或已经验证的其他方法（独立的方法）进行比较。必要时，应包括对强力破坏试验条件下（即光、热、湿度、酸/碱破坏及氧化条件下）获得的样品的测定。对于含量，需要比较两种方法的结果；对于杂质检查，需要比较杂质的概况。峰的纯度试验对显示被测物色谱峰是单个还是多个成分是很有用的（如二极管阵列）。对色谱方法，应用典型的色谱图来证明专属性，并在图上恰当地标出每一种成分。其他分离技术也应有类似的考虑。在色谱方

18、法中，应在一定程度上考察临界分离。对临界分离，可用两个洗脱程度最接近的化合物的分离度来证明其专属性。线性 Linearity测试线性的目的是为了证明整个分析系统（包括检测器和数据采集）有线性的响应和/或在相应的分析物浓度范围内直接成正比。线性关系是在检测方法的范围内（见第6.10节）对方法进行评价。可用所建议的检测方法，直接对原料药（用标准储备溶液稀释）进行测定，以证明其线性。对于低浓度的溶液，可通过稀释储备液配制。线性应通过目测一组信号与被分析物的浓度或含量做图的关系来评价。如果有线性关系，可用适当的统计方法对测试结果进行评估，如用最小二乘法计算回归线。由线性回归估算所测得的数据本身有助于数

19、学评价线性的程度。一些检测方法无论经过何种转换都不显示线性。在这种情况下，分析的响应值应用样品中被分析物的浓度（含量）的适当函数来表示。应提交回归线的相关系数、y轴上的截距、回归线的斜率。还应提交数据图表。也可包括其他的统计参数。另外，分析真值与回归线的偏差也有助于对线性作评价。为建立线性，建议至少用5个浓度。若用其他方法则应证明其合理性。范围特定的范围一般是从线性研究中得到的，并由检测方法期望的应用目 的决定。范围是通过检测方法在指定的范围内或在范围的极限时都达到可接受程度的准确性、精密度来建立的。应考虑如下的最小规定范围：对原料药的含量测定：通常至少应涵盖测试浓度的80%120%内；对于有

20、关物质测定：应至少涵盖有关物质的报告限至标准的120%。对已知有异常功效的、有毒的或有意外药理作用的有关物质，其检测限和定量限应与该有关物质必须被控制的水平相对应。在研制阶段进行杂质检查方法验证时，有必要根据建议（可能）的限度来考虑范围。如果用一个实验同时进行含量测定和纯度检查，且仅使用100%的标准，线性范围应至少涵盖从杂质的报告水平至含量标准的120%。准确度 应在检测方法规定的范围内建立准确度。原料药含量 Drug Substance Assay有多种方法可用于测定准确度：用该检测方法去测定已知纯度的被分析物（例如：标准物质）；将建议采用的检测方法的结果与另一种成熟的、准确度已经确定和/

21、或定义了的检测方法（独立的方法）的结果相比较；准确度可以在精密度、线性和专属性建立后，推论而得。有关物质（定量） 准确度应通过分析加入了已知量有关物质的样品的方式来评价。在不能获得某种有关物质和（或）降解产物的样品情况下，可以考虑与另一种独立的方法测得的结果相比较。应明确单个或总的有关物质是如何测定，例如：在任何情况下，可用与主要被分析物所占的重量百分比或面积百分比。建议的数据准确度的评价应至少涵盖所规定的线性范围的3种浓度水平的、不少于9次的测定（例如：按完整检测步骤对3种浓度分别测定3次）。加入已知量的原料药或有关物质：回收率应报告百分回收率（与已知加入量的结果进行比较）。用检测方法分析已

22、知纯度的样品（标准物质）：回收率应报告测得的平均值与可接受的真实值之间的差异及其置信区间。将检测方法与另一种已良好定性的方法（参照方法）进行比较：回收率应报告测得的平均值与用参照方法测得的结果之间的差异及其置信区间。精密度 Precision精密度包括重复性、中间精密度、重现性。重复性Repeatability至少测试6份100%浓度的样品溶液或9份覆盖方法规定范围的样品溶液。推荐使用真实样品，并对每个重复分析进行完全的测试。可用有代表性的样品进行含量的重复性测试。如果是有关物质测试，仅在无法得到含某种有关物质的样品时可向样品中加入有关物质。或者，可使用强制降解样品或未加样的原料药样品。中间精

23、密度应确定随机事件对检测方法精密度的影响。影响因素通常指不同的日期、不同的分析员、不同的设备等，这些因素不需要进行单独的评估。中间精密度可在影响因素变化时重复测试得到。不需要单独考虑这些影响。（例如：可通过2名分析员在不同的日期或用不同的设备重复重复性或线性或准确度试验，以得到精密度）。重现性 重现性通过在不同实验室间进行测试的平均值进行评估。建议的数据在研究每一种精密度时，都应报告标准偏差、相对标准偏差（变异系数）和置信区间。检测限和定量限检测限的测定是通过对一系列已知浓度分析物的样品进行分析，并以能可靠地测得被分析物的最小量来建立。定量限的测定一般通过对一系列含有已知浓度被分析物的样品分析

24、，在准确度和精密度都符合要求的情况下，来确定被分析物能被定量测得的最小量。根据信噪比（S/N）测定该方法仅适用于出现基线噪音的检测方法，例如色谱法。信噪比的测定是通过比较含有已知低浓度被分析物的样品与空白样品的测定信号，来建立检测限和定量限。对于估计LOD，信噪比在3：1或2：1之间通常是可接受的；对于估计LOQ，典型的信噪比为10：1。根据响应值的标准差和斜率该方法适用于滴定、紫外和原子吸收光谱法等。检测限和定量限判定方法如下：LOD =3.3/SLOQ =10/S以上公式中，是响应值的标准差，S是校正曲线的斜率。斜率S可从被分析物的校正曲线来估算，的值可用下面的方法估算：基于空白的标准差，

25、通过分析适当数量的空白样品，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小。基于校正曲线，研究含有检测限或定量限范围内的被分析物的样品以得到特定的标准曲线，回归线的剩余标准差或回归线的y轴截距标准偏差都可作为标准偏差。建议的数据必须提供检测限/定量限和测定检测限/定量限的方法。如果检测限是根据信噪比得来的，应提供相关的色谱图作为证明。如果是通过计算或外推法得到检测限的估算值，可对一系列接近或等于检测限度样品的逐个检测来论证这一估算值。可通过分析适当数量，已知浓度的接近或等于定量限的样品来证明定量限。耐用性 需测试此参数的方法包括含量和纯度。依据所研究的检测方法的类型，应在开发检测方法阶段评

26、估耐用性。与所描述的方法比较，以一系列变动的条件来分析相应的溶液进行评估。通过分析一系列被处理过的试液来评估。耐用性评估的结果应是建立一系列的系统适用性参数（如分离度试验），以确保在任何时候使用该检测方法都是有效的。应展示典型的图谱。对于液相色谱，典型的变量是流动相的pH、温度和流速、流动相的组成、不同批号或不同供应商的色谱柱等。对于气相色谱，典型的变量是不同批号或不同供应商的色谱柱、温度和流速。如果样品制备时需过滤，应证明过滤前后样品的一致性。如果样品需要超声和/或混合时，应评估样品制备时的超声和/或混合时间。当溶液放置时间超过24小时或指定时间时，应评估检测方法的分析物的溶液稳定性。稳定性

27、指示性质 在对稳定性指示方法进行验证时应评估稳定性指示方法（强制降解），应包括表3中列出的空白剂、活性成分和配方颗粒的强迫降解条件。表3：稳定性指示分析的强降解条件处理Treatment极端强降解条件Extreme stressed condition酸Acid样品/2N HCl，回流4小时Sample/2N HCl, reflux 4 hours碱Base样品/2N NaOH，回流4小时Sample/2N NaOH, reflux 4 hours氧化剂Oxidative样品/3% H2O2/室温，24小时Sample/3% H2O2/room temperature, 24 hours热Th

28、ermal样品/干燥/烘箱内105加热，5天Sample/dry/heat in oven at 105热/湿度Thermal/Humidity样品/顶空湿度饱和（MSH）/烘箱内90，48小时Sample/ Moisture Saturated Headspace/ oven at 90湿度Humidity样品/干燥器内加水/室温，5天Sample/desiccators with water/room temperature, 5 days阳光测试Sun test样品/UV/5天Sample/UV/5 days光稳定性Photo stability样品/干燥/UV下5天Sample/dry/under UV, 5 days样品溶液/UV下，5天，无色烧瓶Sample solution/ under UV, 5 days, clear flask样品溶液/UV下，5天，棕色烧瓶Sample solution/ under UV, 5 days, amber flask按照降解约为10%-20%来选择条件。对于API不需要同样的降解条件。溶液稳定性如果主峰面积（浓度）变化不大于2.0%（或根据具体方案规定的限度），则可认为用于含量检测的对照品溶液和样品溶液是稳定的。当杂