实验九噬菌体效价的测定

1、关于实验九噬菌体效价的测定第1页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三目的要求1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法2、观察噬菌斑的形态第2页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三实 验 内 容 一培养基和实验物品的准备第3页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三本次实验准备工作（2人/组）1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6 ）； （已准备好）。2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液 3支/组，分装于18180mm试管；3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（1.5%的琼脂）底层用，100ml/组，装于250ml三角瓶， （用于制备

2、6个无菌平板，倒薄一点）4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂），融化后分装于15150mm试管中加塞包扎灭菌，6支/组； （教师已准备好）5、1ml无菌吸管 5支/组。第4页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三实 验 内 容 二噬菌体知识介绍第5页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三一、几个重要概念1、噬菌体：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，分布极广，个体很小，在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。第6页，共40页，2022

3、年，5月20日，22点9分，星期三2、噬菌斑： 在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞裂解形成的，其形状、大小不等。3、噬菌体效价： 指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌体（烈性噬菌体）数量噬菌斑形成单位（pfu，plaque-forming unit）。效价（titre，titer）这一名词在不同的场合有其不同的含义（如抗生素等）。第7页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三二、病毒粒子的构造（模型）第8页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三噬菌体的形态及分类科属第9页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三大肠杆

4、菌T4噬菌体结构示意图第10页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三大肠杆菌T4噬菌体结构示意图及电镜照片头部六角形基板领环螺旋形尾鞘核心或管（中空）尾刺或刺突尾丝第11页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三噬菌斑示意照片宿主细菌菌苔噬菌斑第12页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三大肠杆菌T噬菌斑的表型形态第13页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三三、噬菌体的分类根据噬菌体与宿主菌的相互关系烈性噬菌体（virulent phage） 能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。温和噬菌体（temperat

5、e phage） 噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合态、营养态三种形式。针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、溶源菌第14页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三四、噬菌体繁殖（生活周期）1、吸附2、侵入3、增殖（生物合成）4、成熟装配5、裂解释放第15页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三T4噬菌体吸附和DNA的注入第16页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三T偶数噬菌体感染大肠杆菌的扫描电镜照片第17页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三T

6、4噬菌体的生活周期第18页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三T4噬菌体的装配第19页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三五、噬菌体的应用1、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。2、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞简单得多，且易获得大量的突变体构建基因文库（噬菌体）；基因工程载体；噬菌体展示技术。第20页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三3、细菌感染的诊断与治疗 利用其专一性，可以诊断和治疗一些相关细菌感染性疾病

7、（用于治疗时，其分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治疗已有应用） 但专一性也限制了噬菌体在临床上的广泛应用（人们最需要的是广谱性）。第21页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三六、噬菌体的危害在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使生产难以完成。表现形式：发酵周期明显延长；碳源消耗缓慢；发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现；发酵产物的形成缓慢或根本不形成；用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。第22页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三七、以

8、防为主的措施：1、决不使用可疑菌种； 2、严格保持环境卫生；3、决不排放或随便丢弃活菌液；4、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在3040米高空；5、加强管道及发酵罐的灭菌；6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；7、严格执行会客制度。第23页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三实 验 内 容 三噬菌体效价的测定第24页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三一、噬菌体效价测定的方法（梯度稀释）斑点试验法涂菌平板上滴加稀释液液体稀释试管法以不长菌判断（澄清）双层平板法最常用，相对单层优点较多单层平板法载玻片法快速其它病

9、毒的效价（计数）测定空斑计数、电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝集、ELISA酶标仪）滴度表示第25页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三噬菌体效价测定的方法第26页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三二、双层平板法第27页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三二、双层平板法37约4hr双层平板法双层平板法（1.5%琼脂培养基10mL）双层平板法宿主菌悬液（对数期菌液0.9mL）噬菌体菌悬液（合适稀释液0.1mL）上层培养基（0.8%琼脂培养基5mL）混匀计数第28页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三单层与双层平板法所

10、形成的噬菌斑的比较第29页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三双层平板法的优点：加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补；所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象；因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。 第30页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三三、实验原理一个噬菌体侵染宿主细胞引起裂解扩散重复侵染裂解形成一个噬菌斑（琼脂凝胶中）宿主细胞数远远大于噬菌体数？噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数10稀释倍数第31页，共40页，2022年，5月20日

11、，22点9分，星期三四、实验步骤1、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板6个（倒薄一些），凝固。2、加入大肠杆菌敏感菌 在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液0.9mL。第32页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三3、稀释噬菌体 取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法，分别制备噬菌体稀释液（10-7、 10-8 、 10-9 ）。4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合 将已加有大肠杆菌敏感菌6皿平板（ 10-7 、 10-8 、 10-9各2皿）中，分别加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5分钟。第33

12、页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三5、加入上层培养基 将5mL溶化的半固体培养基中迅速倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板中（4550），并混合均匀。静止凝固。6、培养 37培养5小时或室温培养12小时。第34页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三7、观察、计数 观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑形成单位（pfu）记录于表格内。8、计算噬菌体的效价 按照六个计数原则选择，计算每毫升未稀释的原液的噬菌体效价。噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数10 稀释倍数第35页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三实验步骤框图（教师进行演示操作）用

13、牛肉膏蛋白胨固体培养基倒平板6皿（薄一点） 噬菌体稀释液（10-7、10-8、10-9）0.1mL，各2皿敏感菌菌悬液0.9mL放入已有底层固体培养基的平板中混匀放置5分钟将5mL溶化的半固体培养基中倒入上述平板中（4550）混匀（动作？）37培养4小时或室温培养12小时观察结果计数第36页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三教科书介绍方法的操作步骤噬菌体稀释液0.1ml宿主培养液0.9ml4548溶化好牛肉膏蛋白胨半固体培养基4ml混匀吸附5min搓动混匀后倒于有底层的平板中铺平37 培养56小时，观察计数在无菌空试管中混匀上层后（3种成分），再倒入底层 上铺平。第37页，共40页，2022年，5月20日，22点9分，星期三思考题噬菌体稀释度10-710-810-9123平均123平均123平均pfu数/平板每毫升中的