上海交通大学医学院分子生物学课程DNA3

1、1.HGP的基本目标和任务基本目标与任务 目标：测定30亿个碱基对的排列顺序，确定基因在染色 体上的位置，破译人类全部遗传信息。 任务：在制图的基础上测序，最后获得四张图谱 遗传图 物理图 转录图 序列图第一页，共八十六页。2.HGP发展过程： （1）源起 美国“肿瘤计划”搁浅60年代初期， 肿瘤发病率在世界各国急剧上升美国决心在20年内解决肿瘤的早期诊断和治疗斥资几百亿美元，动员全国的力量几乎所有同细胞增殖有关的基因，都与肿瘤有关人类所有疾病，都直接或间接与基因有关第二页，共八十六页。（2）提议 1985年，美国能源部(Department of Energy，DOE)在加州大学圣克鲁滋会议

2、上第一次对人类基因组全部测序进行可行性论证形成“人类基因组计划”草案。第三页，共八十六页。（2）提议 1986 年，诺贝尔奖获得者 Renato Dulbecco发表于 Science杂志 的短文 肿瘤研究的转折点：人类基因组测序 中高瞻远瞩地率先向世界公开提出人类基因组计划，并倡导全世界有能力的科学家共同完成这一国际性大课题。“如果我们想更多地了解肿瘤，我们从现在起必须关注细胞的基因组 。人类的DNA序列是人类的真谛，这个世界上发生的一切事情，都与这一序列息息相关。”第四页，共八十六页。1987年人类基因组创意报告（美国能源部）1988年人类基因组的作图与测序报告（美国科学院） ，同年底美国

3、国会通过1990年开始实施，预计15年完成，拨款30亿美元. J.Watson担任“国家人类基因组计划研究中心”首任主任第五页，共八十六页。第六页，共八十六页。1997年：大肠杆菌基因组（5Mb）全部测序完成，毛细管测序仪 上市（3）发展1992年：美国和法国的两支研究队伍分别完成了人类染色体 和第21条染色体的第一张物理图谱；随后又分别完成了 鼠和人的遗传图谱。1993年： 位于英国剑桥的Sanger中心加入人类基因组计划，并 成为一个重要的测序中心。1994年：美国与法国完成了人类基因组中的第一个完整遗传连 接图谱1996年：各国科学家聚集在百慕大群岛，讨论并通过了充分体 现HGP精神 （

4、全球共有，国际合作，即时公布，免费 共享）的百慕大原则。第七页，共八十六页。1998年： Craig Venter宣布成立Celera公司，并 宣称将采用“全基因组鸟枪法”完成人类基因组的全部测序。从此，人类基因组测序在“公、私”之间展开了激烈竞争 线虫基因组测序完成。 （3）发展第八页，共八十六页。第九页，共八十六页。1999年：中国获准参加HGP，承担测定人类基因组1%测序任务；英国日本和美国共同完成了第一条人染色体第22条染色体的全部测序工作。（3）发展第十页，共八十六页。（3）发展2000年： 6月26日，HGP与Celera公司的领导人在白宫的庆祝仪式上共同宣布了人类基因组工作框架图

5、的完成，并约定将双方的研究成果同时发表第十一页，共八十六页。2000年6月公共领域测序计划工作框架图第十二页，共八十六页。2000年Celera公司完成了果蝇基因组(180)的全部测序工作，证明了“全基因组鸟枪法”的可行性；德国和日本的科学家公布了人类第21条染色体的测序结果；第一个植物基因组拟南芥基因组（125Mb）被全部测序。（3）发展第十三页，共八十六页。2001年2月： HGP将人类基因组工作框架图发表在Nature; Celera公司则将其成果发表在Science上。“工作框架图”已能覆盖人类基因组的97%，其中至少92%的序列已组装得准确无误，并显示其中只有3万到3.5万个编码蛋白

6、质的基因，这是人类基因组研究的一个重要里程碑。Celera 公司：Science , 2001, 291:1304-1351 六国科学家：Nature , 2001, Vol.409:860 （作者 274 人，其中中国科学家57 人）（3）发展第十四页，共八十六页。（3）发展2003年4月14日当地时间11时美国HGP负责人Collins F.在华盛顿宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现第十五页，共八十六页。2006年5月18日 人类最后一个染色体1号染色体基因测序完成，发表在Nature上。至此“生命之书”覆盖基因组99.99%。第十六页，共八十六页。3.我国对

7、人类基因组计划的贡献我国是一个人口大国，丰富的人群遗传资源 1994年，在吴旻、强伯勤、陈竺、杨焕明的倡导下启动中国HGP 1998年，国家自然科学基金会和863高科技计划的支持，先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构和功能研究”；1998年，在上海成立了南方基因中心；1999年，在北京成立了北方人类基因组中心；1999年7月，在国际人类基因组注册，得到完成人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序任务，该区域约占人类整个基因组的1。第十七页，共八十六页。国际人类基因组测序任务分配情况第十八页，共八十六页。遗传图谱转录图谱0.7 cM 或

8、kb 序列图谱物理图谱100 kbSTS map四张图：遗传图、物理图、序列图、转录图4.HGP的主要内容第十九页，共八十六页。（1）遗传图（genetic map,又称连锁图） 指基因根据重组频率在染色体上的线形排列和分布。是以具有遗传多态性的遗传标记为路标,以遗传学距离为图距绘制的基因组图。遗传多态性：在某个遗传位点上具有一个以上的等位基因,且其在群体中出现的频率均高于1%。遗传学距离：在减数分裂事件中,两个位点之间进行交换、重组的百分率,规定1%的重组率为1c(厘摩尔根）。cM值越大，两者之间距离越远。第二十页，共八十六页。第二十一页，共八十六页。第一代多态性标记: RFLP（restr

9、iction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）不同个体的DNA在用某种限制性内切酶水解时，会产生两种不同长度的水解片段。由一个多态性位点出现在某种限制性内切酶的酶切位点上造成的。第二十二页，共八十六页。缺点：数量较少，信息量有限第二十三页，共八十六页。 第二代多态性标记 微卫星标记 （microsatellite marker，MS), 简短串联重复序列 （short tandem repeat，STR）, 短序列长度多态性 （short sequence length polymorphism ,SSLP) 重复单元2-6bp， 多态性主要来自

10、重复序列拷贝数的变化第二十四页，共八十六页。优点：高度多态性，信息量大， 符合孟德尔遗传规律 可采PCR使操作自动化CTAGCTTATATATATATATATATATATATAAGCTTGC1994年底，完成由RFLP和STR组成的遗传图谱， 包括5826个标记，分辨率为0.7cM第二十五页，共八十六页。第三代多态性标记： 单核苷酸的多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性。 人类基因密码差异不到0.1，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是SNP产生的，它构成了不同个体的遗传基础。第二十六页，共八十六页。第

11、二十七页，共八十六页。特点：SNP在基因组中的数目多，可达到300万个，平均每1000个碱基对就有一个。因而成为一种信息量非常大的遗传标记系统。SNP可能在密度上达到人类基因组“多态”位点数目的极限。SNP与RFLP、STR等DNA标记的不同,是不再以“长度”的差异作为检测手段,而直接以序列的差异作为标记。SNP为DNA芯片技术应用于遗传作图提供了基础。第二十八页，共八十六页。定位基因的重要手段，大致了解各个基因或DNA片断之间的相对距离与方向研究人类基因组遗传与变异的重要手段意义：第二十九页，共八十六页。(2)物理图（physical map) 以已知核苷酸序列的DNA片段为“位标”（ ST

12、S），以DNA实际长度为图距的基因组图谱。 第三十页，共八十六页。标记：序列标记位点(sequencetagged site，STS)。指基因组中任何单拷贝的长度在100500bp之间的DNA序列，与核酸内切酶识别序列相关联。在基因组中有明确位置。图距：Mb或Kb第三十一页，共八十六页。主要内容：建立含有STS对应序列的相互重叠连接的DNA片段重叠群（Contig）只要有一定数量的STS标签，所有DNA大片段在该染色体或基因组中的位置都能被确定。1995年，完成分辨率为200kb，以STS为标志的物理制图第三十二页，共八十六页。意义: 把遗传学的位点信息转化为基因组位点的物理信息 基于STS位

13、点信息的大片段DNA克隆重叠群(clone contig)提供基因定位的参考依据第三十三页，共八十六页。(3)序列图最详尽的物理图。测定总长约lm、由30亿个核苷酸组成的全序列。既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和HGP的基本目标第三十四页，共八十六页。(4)转录图(基因图谱）目的：在人类基因组中鉴定出全部基因的位置、结构、功能。方法：把mRNA先分离、定位，再转录成cDNA片段，就构成一张人类基因的转录图。cDNA片段又称表达序列标签(expressed sequence tag，EST) 。 EST：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的

14、部分cDNA的5或3端序列称为表达序列标签（EST），一般长300-500bp左右。 第三十五页，共八十六页。意义有效反映在正常或受控条件中表达的全基因的时空图EST除提供序列信息外，同时也提供了该基因表达的组织、生理状况与发育阶段的信息。第三十六页，共八十六页。 1990年，提出了HGP的大规模cDNA测序研究战略并建立了EST技术。至1998年，公共数据库中EST序列已达一百多万条，加上各公司已测但未公布的数据，估计现有的EST已包含了绝大多数的人类基因序列。 第三十七页，共八十六页。 5.HGP的大规模测序方法 （1）实验室测序 Sanger的末端终止法：在PCR时加入荧光标记的复制终止

15、剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基）ddX的两个作用：可以当作正常碱基参与复制一旦链入DNA中，反应终止电泳谁终止，碱基就是谁此方法获1974年的Nobel奖第三十八页，共八十六页。第三十九页，共八十六页。第四十页，共八十六页。第四十一页，共八十六页。（2）大规模测序与实验室测序的不同实验室测序： 手工操作，效率低，结果是第一位的 大规模测序： 流水线操作，自动化 追求稳定、高效、低成本第四十二页，共八十六页。（3）大规模测序基本策略 基于BAC的逐个克隆法： 先把基因组打碎成200300kb的片段并制成BAC文库，再对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进一步打碎成小片段，进

16、行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）全基因组鸟枪法（Shotgun)： 直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装（美国Celera公司）第四十三页，共八十六页。1）基于BAC的方法全基因组DNA随机打成大片段选择并克隆大片段排序，选择再打碎，克隆，测序，拼接第四十四页，共八十六页。细菌人工染色体（BAC)Bacterial Artificial Chromosome Plasmid transforming and cloning in bacteriarange from 100 to 300 kbp Stable 第四十五页，共八十六页。2）Shotgun测序DNA片

17、段的制备：将DNA用超声波切成能够测序的小片断转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增。提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒电泳检测：检测质量的好坏测序：上测序仪测序第四十六页，共八十六页。Shotgun测序第四十七页，共八十六页。DNA全自动分析仪：ABI Prism 3700型全自动遗传分析仪安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000 第四十八页，共八十六页。DNA的鸟枪法测序的优缺点：优点：速度快 缺点：随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误第四十九页，共八十六页。拼接错误：Repea

18、t的存在第五十页，共八十六页。拼接软件的新需求能充分利用正反向测序的配对信息, 避免重复序列造成的错误拼接能处理数以百万甚至千万计的数据 程序并行化 高效率比对 能逐步拼接第五十一页，共八十六页。第五十二页，共八十六页。6.人类基因组序列图基本信息由28.5亿bp组成：个人差异：0.1 外显子1.1，内含子24，间隔序列75含22.5万基因基因重复片段高达5.3 人类基因组人类蛋白质61%与果蝇同源43%与线虫同源46%与酵母同源80与小鼠同源第五十三页，共八十六页。公用基因组浏览器美国国立卫生研究院（NIH）美国国立生物技术信息中心（NCBI）的Genbank美国圣克鲁斯加州大学（UCSC）

19、的UCSC基因组浏览器英国Wellcome Trust Sanger研究所和欧洲分子生物学实验所（EMBL）欧洲生物信息学研究所的总基因组浏览器 日本DNA数据库 EMBL的核苷酸序列数据库的EMBL-Bank，网址为：第五十四页，共八十六页。1.功能基因组学 分析序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基因的表达及其调控模式。 核心问题： 1）基因组多样性的研究 2）基因组的表达调控和蛋白质组学的研究 3）模式生物体（Model Organism）作为 功能基础组学工具 三、后基因组计划第五十五页，共八十六页。1）基因组多样性的研究疾病基因组学 通过分析细胞在正常和患病状态下表达基因谱的差异

20、，寻找与疾病发生发展相关的关键基因。 第五十六页，共八十六页。环境基因计划 (Enviromental genome project,EGP) 研究对环境发生反应的基因中多态性对其功能的影响以及在流行病学中研究基因与环境的相互作用。第五十七页，共八十六页。药物基因组学（Pharmacogenomics) 研究所有与药物作用有关的基因在不同个体的多样性，以及这些多样性对药物的疗效、毒性或不良反应等的影响。药物遗传多态性：药物代谢酶、药物受体、药物靶标第五十八页，共八十六页。药物分析：寻找药物靶点，进行大批量药物筛选和分析。药物设计：针对基因组多样性设计更安全有效的个性化治疗方案目标：临床个体化用

21、药数据处理和关联分析发现药物作用对象确定靶目标分子针对靶目标进行合理的药物设计第五十九页，共八十六页。 国际单体型图谱计划 （haplotype map,HapMap) 绘出人类基因组的单体型模块，以及与此相关的单核苷酸多态性标记。2002年10月启动。单体型：一个染色体区域中所有相关联的SNP等位基因的集合。这些SNP之间高度相关。单体型模块：一个在历史上从未发生重组，并且只存在几个单倍型的染色体区段。意义：为疾病相关基因寻找提供有效研究工具第六十页，共八十六页。人类基因组多样性计划(human genome diversity project,HGDP) 采集世界各地人群标本，鉴定人群基因

22、组的多态性，建立资源库储存世界人群多样性的信息及遗传统计数据和各种生物样本。第六十一页，共八十六页。2）基因组的表达调控和蛋白质组学的研究蛋白质组(proteome)： 由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个动态的概念。双向凝胶电泳（2dimentional gel electrophoresis,2-DGE）质谱鉴定（mass spectrometry,MS）计算机图像数据处理和蛋白质数据库蛋白质芯片第六十二页，共八十六页。生物信息学以大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门学科。由

23、数据库、计算机网络、和应用软件组成。第六十三页，共八十六页。研究热点：序列对比基因识别和DNA序列分析蛋白质结构预测分子进化数据库中知识发现（Knowledge discovery in database,KDD)第六十四页，共八十六页。常用数据库The human genome organization Genbank 基因图谱 蛋白质结构数据库（PDB） 蛋白质序列数据库(Swiss-Prot) 第六十五页，共八十六页。目的：利用模式生物基因组与人类基因组再编码序列和组织结构上的同源性，用单一或简单的生物模式阐明人类基因组在结构和物种进化的内在联系。3）模式生物体（Model Organi

24、sm）作为 功能基础组学工具第六十六页，共八十六页。要求:成本便宜，供应量高容易安置繁殖容易，世代间隔短，生产量大容易操作处理基因量小而简单。第六十七页，共八十六页。Model Organisms Used in Genomics第六十八页，共八十六页。(1)大肠杆菌（Escherichi coli)原核生物模式生物第六十九页，共八十六页。(2)果蝇（Drosophl melanogaster , Fruit Fly）果蝇是遗传学和分子发育生物学的国王，研究信号传递的模式生物。 日变周期老化性行为成瘾行为第七十页，共八十六页。（3）美丽线虫 (Caenorhabditis elegans,C.

25、Elegant)第一个完成基因组测序的多细胞生物细胞分裂与分化的调控的研究细胞凋亡的研究第七十一页，共八十六页。（4）酵母(Saccharomyces cerevisiae,Yeast)细胞周期核DNA修复的模式酵母双杂交技术的发展第七十二页，共八十六页。（5）小鼠(Mus musculus,Mouse)2002年12月完成基因草图小鼠的蛋白质与已知的人类蛋白质的结构很相似，与人的同源性高达80%理想的模式生物，与人亲缘最近。第七十三页，共八十六页。6)其它模式生物 拟南芥(Arabidopsis thaliana ) Nature 408:796-815 (2000)第一个植物的全基因组全长

26、125Mb，10条染色体，25,498个基因。 第七十四页，共八十六页。共同特征：基因组比较小，编码基因比例高，重复序列少GC含量高，CpG岛比例也较高。和进化程度成反比。有重复序列存在，小鼠和人类比例最高不同物种中，重要生物功能由同源序列基因蛋白承担。同线（Synteny）的同源基因在不同物种基因组中有相同连锁关系生物体复杂性与基因组的C值大小及基因数量未必呈线性关系第七十五页，共八十六页。2.比较基因组学在基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。意义：根据对一种生物相关基因的认识来理解、诠释和克隆分离另一种生物的基因。第七十六页，共八十六页。水稻基因组（Rice Genome）2001年10月，中科院、科技部和国家计委联合向全世界宣布，中国率先完成水稻（籼稻）基因组工作“框架图”的绘制2002年4月5日，在Science 杂志上以封面文章的形式发表。 其它生物基因组研究第七十七页，共八十六页。黑猩猩基因组2005年9月1日“黑猩猩测序和分析联盟”在Nature和S