双水相萃取的应用

6/6双水相萃取的应用双水相萃取在蛋白质分离纯化中的应用双水相萃取技术(Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实

现分离；其双水相体系可由高聚物/高聚物双水相体系、高聚物/无机盐双水相体系、低分子有机物/无机盐双水相体系、表面活性剂双水相体系等组成，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。同时，双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视；此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高【1】。

1、近年来双水相萃取技术研究综述概述

由于双水相萃取技术在生物工程、医药分析、金属及一些煤矿等化学分析中具有重要作用,因此也一直是分离提纯领域研究的热点。特别是在近几年，随着生物工程技术、生物化学技术、高分子技术的发展，双水相萃取技术的研究也取得了较快的发展。

2008年，郭宪厚【2】对双水相萃取技术进行了综述,阐述了双水相萃取技术的基本原理、特点、工艺流程、物质分配平衡的影响因素及其在生命科学，复杂中药体系的分离以及重金属回收等方面的应用，并对双水相萃取技术的发展前景作了展望。2009年，徐长波、王巍杰【3】对双水相萃取技术进行了综述，并发表了《双水相萃取技术研究进展》，以此综述了双水相萃取技术基本原理、特点、应用及热力学模型,并对双水相萃取技术存在的问题和发展趋势作了论述。2010年，马春宏、朱红【4】等，发表了《双水相萃取技术的应用研究进展》，对双水相萃取技术的具体应用进行了相关综述，简单介绍了双水相萃取技术及其原理、特点,综述了双水相体系在生物工程(其中包括萃取分离抗生素、酶、分离提纯蛋白质和萃取其他生物活性物质)、药物分析和金属分离等方面的应用。2010年，姜大雨、朱红【5】对离子液体双水相萃取的应用研究进行了综述，指出了离子液体双水相的研究取得的一些阶段性的成果，介绍了离子液体双水相体系及其优点,综述了离子液体双水相体系在生物工业分析、药物分析和金属分离等方面的应用，同时展望了离子液体双水相体系的应用前景。2010年，谭志坚、李芬芳、邢建敏

【6】，发表了《双水相萃取技术在分离、纯化中的应用》对对双水相萃取技术的相关具体应用细节进行了较为详细的论述，综述了双水相形成原理、工艺流程和特点、体系类别、影响双水相分配的因素及其在分离纯化中的应用。2011年，刘云【7】对双水相萃取技术的国内研究和工业应用做了相关的综述，也对其进行了系统的概括。

2、近年来双水相萃取技术的应用概述

近年来，随着双水相萃取技术理论研究的不断深入，其在科研中的实际应用也不断扩展，涉及到了生物工程、蛋白质工程、基因工程等多个领域，以及蛋白质、酶、糖类及其他一些生物化学物质。

2009年，徐长波、王巍杰【8】，用双水相萃取技术从钝顶螺旋藻中分离纯化藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,C-PC)；采用双水相体系直接从C-PC粗提液中分离纯化C-PC,研究了双水相的类型、成相盐的种类、聚合物的平均分子量和浓度、成相盐的浓度、体系pH以及中性盐的类型和浓度对C-PC分配影响,确定了分离纯化

C-PC的双水相类型为聚合物/盐系统。2009年，董树国、赖红伟、陆钊【9】，发表了《双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用》，对双水相萃取技术在黄酮类化合物分离分析中的应用进行了具体的论述。2009年，李敏、董慧茹【10】在《双水相萃取-高效液相色谱法测定酵母细胞中麦角固醇含量》中详细介绍了乙醇-

水双水相萃取-高效液相色谱法测定酵母细胞中麦角固醇含量的分析方法。2008年，张亚杰，夏杰，陆兵等【11】采用双水相萃取与疏水层析分离纯化重组巴氏毕赤酵母表达的基因工程人溶菌酶。结果表明:当双水相萃取的pH为4,硫酸钠、氯化钠、PEG4000的质量浓度为0.13、0.06和0.08时,人溶菌酶上相回收率达98.8%,纯化因子18.0,浓缩因子3.6。

3.双水相萃取技术与传统分离萃取技术相比的优缺点

与传统的萃取及其他分离技术相比，双水相萃取对生物物质、天然产物、抗生素等的分离、提取、纯化表现出以下优势：

(1)整个体系含水量高(70％--90％)，萃取是在接近生理环境的体系中进行，不会引起生物活性物质失活或变性；

(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；

(3)传质速率快，分相时间短。双水相体系中，含水量高，界面张力小，故传质和平衡速率较快；

(4)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；

(5)单级分离提纯效率高。通过选择适当的双水相体系，一般可获得较大的分配系数，也可调节被分离组分在两相中的分配系数，使目标产物有较高收率。

(6)处理量大，能耗低，易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；

(7)操作条件温和，所需设备简单，整个操作过程在常温常压下进行；大量杂质可与固体物质一同除去，简化分离操作过程；

(8)分配过程因素较多，可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。

正是这些优势使ATPE能广泛应用于生物工程、药物分析和金属分离等方面。特别是近年来离子液体双水相萃取技术作为一种高效而温和的新型绿色分离体系,离子液体双水相体系结合离子液体和双水相萃取的优点，萃取过程中在保持生物物质的活性及构象等方面有明显的技术优势。

但是双水相萃取技术自身也存在一些不足之处,如易乳化,相分离时间较长,分离效率不高等,一定程度制约了双水相技术的工业化推广与应用。

4.双水相萃取技术机理

4.1双水相系统的形成机理

将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系【4】，双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。

与一般的水-有机溶剂体系相比较，双水相体系中两相的性质差别（如密度和折射率等）较小。由于折射率的差别甚小，有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也很小，仅为10-6～10-4N·m-1（一般体系为10-3～10-2N·m-1）。界面与试管壁形成的接触角几乎是直角【2】。

4.2双水相中影响蛋白质分配的因素

1．聚合物分子量：同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强，当聚合物的分子量减小时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。如在PEpDextran系统

中，PEG的分子量减小或Dextran的分子量增大都会使分配系数变大，相反PEG的分子量增大或Dextran的分子量减小会使分配系数变小。王旭等将PEG400、PEG600、PEG1000分别配成质量百分浓度为30%的溶液,PEG1000的溶液中酶活活性比最大,说明其对果胶酶活性的影响最小【12】。Vaidya等也认为小分子量的PEG不适合分离蛋白质。PEG相对分子量为2000时，虽然PF及Y值略有减小，但是Kp较小，仅为3.9。

2.中性盐：在双水相体系中加入电解质,由阴、阳离子在两相中的分配差异,形成穿过相界面的电位,从而影响带电大分子物质在两相中的分配,强化分配效率,通常选择NaCl作电解质。张兰威等加入不同浓度NaCl,通过其分相参数研究电解质对蛋白酶纯化的影响,结果添加NaCl对蛋白酶的分离无强化作用,相反不添加NaCl的体系各项指标都较好,故确定不添加NaCl的双水相体系[18]。焦庆才用PEG/(NH4)2SO4体系分离发酵液中α2淀粉酶和蛋白酶时也得到同样结果。

3.荷电PEG作为成相聚合物：在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差，故可在PEG或葡聚糖上引入带电基团来改变蛋白质的分配。因相间电位差与电荷数成反比，而每个葡聚糖分子上可引入的带电基团较多，故效果较差。相反，每个PEG分子只含两个羟基，只需引入两个荷电基团，电场增大的效果就较好。

4.PH值：体系PH值会影响蛋白质分子可离解基团的离解度，从而改变蛋白质的表面电荷数来影响分配。同时PH值还会影响缓冲离子如HPO42-、PO43-等的分配，以改变相间电位来达到改变分配系数的目的。另外在研究分配系数与PH值的关系时，若加入不同种类的中性盐，由于电位差的不同，其相应关系也不同。杨辉等研究表明果胶酶的分配系数K值随PH值的增加先是增加达到最大值后逐渐下降，当PH增加到

5.0时，果胶酶在PEG/(NH4)2SO4双水相系统中有最大的分配系数K=11.40。

5.有机溶剂：在双水相体系中添加少量有机共溶剂，使得体系中的一部分水被有机共溶剂所取代，导致两相界面处的疏水性能差异发生变化，同时界面张力以及电位差也随之改变，从而影响了蛋白质的分配。通常认为，有机共溶剂对被分配物质分配行为的影响更主要是有机溶剂和成相高聚物相互作用的结果。

6.表面活性剂:Bodhankar和Gaikar等研究了四类表面活性剂，即阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂在

PEG-Dextran体系中对物质分配的影响。实验表明，添加表面活性剂可以改变界面张力、上下相组成等两相特性，从而对物质的分配行为进行调节。

7.疏水基团:在聚合物上接枝疏水基团后，疏水性成为影响蛋白质分配的主要因素。这种疏水性的影响由连接在高聚物上疏水基的大小和蛋白质分子疏水区域的数量以及疏水区的粘结强度所决定。实验表明，在P-PEG浓度很低的情况下，血清白蛋白和乳球蛋白因易于同非极性的P-PEG结合，所以不断向上相富集。

8.亲和配基:在聚合物上接上一定的亲和配基，不仅能提高萃取分配的专一性，而且能增大处理量。也可同时使用两种配基，从而增加系统的选择性，完成多种酶的分离和回收。

5．近几年双水相萃取的主要应用

由于双水相具诸多优点，使其广泛的应用于对于分离环境要求较高的生物活性物质的分离与纯化。主要是分离蛋白质，酶，病毒，脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等。此外双水相还可用于稀有金属／贵金属分离，传统的稀有金属／贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等缺点。双水相技术萃取技术引入到该领域，无疑是金属分离的一种新技术。吴晓婷研究发现双水相纯化方法的纯化倍数（10.69倍）和回收率（53.36%）比传统的离子交换层析纯化方法高。并且双水相萃取方法简单，更适合乙醇脱氢酶的纯化【13】。Tubio等【14】研究确定了从α-胰凝乳蛋白酶(ChTRP)中分离胰岛素(TRP)的最佳条件,并将其应用到用聚乙二醇/柠檬酸钠(PEG/NaCit)双水相体系从牛胰腺中液-液萃取胰岛素。朱慎林、朴香兰、沈刚等人用溴化十二烷基三乙铵（C12NE）与十二烷基硫钠（SDS）混合体系形成双水相萃取苯丙氨酸表明，当C12NE与SDS摩尔比在1.6～1.7的狭小区域内才能分相，分相系统对苯丙氨酸的单级萃取率达到80%以上，随着苯丙氨酸浓度的增加，分配系数略有下降。二级萃取率达到99%以上【15】。Salabat等【16】研究了L-色氨酸、L-苯基丙氨酸、L-酪氨酸3种氨基酸298.15K时在聚乙二醇+盐+水双水相体系中的分离现象,分相盐为硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵,并且还研究了连接线长度、盐、侧链结构对氨基酸分配系数的影响；结果表明,增加氨基酸的疏水性和连接线的长度会使分配系数相应的增加。

6．双水相萃取技术在以后发展中的努力及前进方向

双水相技术作为一种很有发展前景的生化分离单元操作,但其自身也存在一些不足之处,如易乳化,相分离时间较长,分离效率不高等,一定程度制约了双水相技术的工业化推广与应用【5】，双水相萃取技术与其他相关的生物分离技术进行有效组合,可以进一步提高分离效率或解决各自存在的难点问题。目前,双水相萃取技术的研究进展集中表现在:廉价双水相体系的开发、新的双水相体系探索、双水相萃取技术同其他技术集成化、双水相萃取相关理论的进展等方面。

5.1双水相萃取技术与其他技术的集成

双水相萃取与相关技术的集成可以归纳成为以下3个方面:①与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等常规技术实现集成化,改善了双水相萃取技术中诸如成相聚合物回收困难、相分离时间较长、易乳化等问题,为双水相萃取技术的进一步成熟、完善奠定了基础；②与色谱技术等新型生化分离技术实现过程集成,充分融合了双方的优势,既提高了分离效率,又简化了分离流程；③将生物转化、化学渗透释放和电泳等技术引入双水相分配,给已有的技术赋予了新的内涵,为新分离过程的诞生提供了新的思路【19】。

5.2新型双水相萃取技术

（1）双水相萃取与磁性离子交换剂分离结合，可根据蛋白质的分配系数差异和表面电复杂生物样品中蛋白质的逐级选择性分离，实现对特定高丰度蛋白的分离或低丰度蛋白的富集有待进一步研究【17-18】。

（2）微胶囊双水相萃取技术。该技术避免常规分离技术过程中的高温、氧化、聚合等情况发生,并且使其工艺步骤少,提取效率高,能耗及生产费用低。

（3）亲和双水相萃取技术是在组成相系统的聚合物(如PEG、葡聚糖等)上耦联特定的亲和配基。亲和吸附具有专一性强、分离效率高等特点。利用其特点,将亲和吸附与双水相萃取技术相结合,从而构成亲和双水相萃取体系。该体系不仅具有萃取系统处理量大、放大简单等优点,而且具有亲和吸附专一性强、分离效率高的特点。

（4）生物转化与双水相萃取技术相结合。在生物转化过程中，随着转化的产物量的增加，常会抑制生化过程的进行。因此，及时移走产物是生化反应中的主要问题之一。将双水相系统与生物转化相结合，形成双水相生物转化，解决了

生物转化过程中存在的产物抑制以及生物催化剂回收利用两方面的问题，为生物转化赋予了新的内涵【3】。

7.小结

ATPE是一项可以利用不复杂的设备，并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分的新型分离技术。但ATPE技术在工业中还没有被广泛利用。一方面是因为两相间的溶质分配对于具有高度选择性、需要从上千种蛋白中分离一种蛋白这种情况提供了很小的范围。另一方面，如何从聚合相中回收目的产物、循环利用聚合物与盐以降低成本问题还有待进一步研究。目前ATPE技术应用的主要问题是原料成本高和纯化倍数低【2】。因此，未来双水相萃取技术的发展方向因该集中在：对液-液相平衡热力学模型的探索，应该加快基础数据的收集，寻求一套完整的理论依据；新型双水相体系的开发，寻找更加廉价高效的双水相体系；新工艺的开发，为实现大规模工业化寻找新思路；双水相萃取技术与相关技术的耦合，扩展双水相萃取的应用领域，减少双水相体系自生的一些缺点带来的影响；废液的回收以及再利用问题，在当今越来越重视人类生存环境的前提下，开发出环境友好、可循环利用的双水相体系是非常有意义的【15】。

【9】董树国、赖红伟、陆钊.双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用.广州化工，2009年07期。

【10】李敏、董慧茹，双水相萃取-高效液相色谱法测定酵母细胞中麦角固醇含量。分析试验室,2009年11期。

【11】张亚杰，夏杰，陆兵等，双水相萃取与疏水层析分离基因工程人溶菌酶，华东理工大学学报(自然科学版)，2008年02期。

【12】BabuBR,RastogiNK,RaghavaraoKSMS.LiquidLiquidExtractionofBromelainandPolyphenolOxidaseUsingAqueousTwo-PhaseSystem[J].ChemicalEngineeringandProcessing,2008,47(1):83—

89.

【13】吴晓婷等.酿酒酵母中乙醇脱氢酶双水相萃取与DEAE-32层析纯化方法的比较.酿酒科技.2009年，第6期（总180期）。

【14】TubioG,PicoGA,NerliBB.Extra