玉米ZmEXO70s基因家族鉴定及苗期耐热性关联分析

本文格式为Word版，下载可任意编辑——玉米ZmEXO70s基因家族鉴定及苗期耐热性关联分析0.05（Lietal.，2022）。使用TASSEL的2个统计模型（Bradburyetal.，2022），即一般线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM）进行SNP分子标记与苗期耐热性的关联分析。其中，GLM是将群体结构考虑在内，结合基因型数据及表型数据进行关联分析;MLM则是将群体结构和亲缘关系均考虑在内，结合基因型数据及表型数据进行关联分析（Zhangetal.，2022b;Lietal.，2022）。

1.5AM368群体苗期耐热存活率表型

在长江大学农学院的步入式生长温室中对AM368群体自交系进行6次苗期耐热表型鉴定。以玉米苗期高温存活率为统计指标，试验设2次重复，采用随机区组设计。每个小钵子种植12棵玉米，称取一致重量的土壤基质，严格操纵土壤基质的重量和水分，待幼苗生长至3叶1心期时，对其进行42℃高温胁迫处理。当玉米出现叶片萎蔫及植株死亡表型时温度降至25℃，并在25℃恢复7d后统计各自交系的存活率。

2结果与分析

2.1ZmEXO70s基因家族成员鉴定及蛋白理化性质分析结果

根据氨基酸序列相像性比对及NCBI数据库BLASTp序列比对等生物信息学分析，共鉴定出36个ZmEXO70s基因家族成员，其GenBank登录号、染色体位置、基因长度及编码蛋白的理化性质如表1所示。36个ZmEXO70s基因分布在10条染色体上，基因序列长度和氨基酸数目各不一致，其中ZmEXO70G1a基因序列长度为228～3726bp，编码75～1241个氨基酸残基，蛋白分子量为8.6～136.6kD，理论等电点（pI）为4.5～9.9，大部分蛋白理论等电点小于7.0。

2.2ZmEXO70s蛋白系统发育进化分析结果

为了探究玉米与其他物种EXO70蛋白的同源进化关系，将已知的23个AtEXO70s蛋白（Chongetal.，2022）、41个OsEXO70s蛋白（Cvr?kováetal.，2022）和本研究鉴定出的36个ZmEXO70s蛋白进行系统发育进化分析，结果如图1-A所示。拟南芥、水稻和玉米的EXO70s蛋白可分为9组（A组～I组），各组数目不一致，以E组数目最少、I组数目最多。结合前人构建的AtEXO70s和OsEXO70s蛋白系统发育进化树（Chongetal.，2022;Cvr?kováetal.，2022），对ZmEXO70s基因家族成员进行系统命名。由图1-B可知，各组蛋白间有较高的同源性，十字花科植物拟南芥的AtEXO70s蛋白在不同组中均聚在同一小分支，OsEXO70s和ZmEXO70s蛋白则聚在其他小分支，究其原因可能是水稻和玉米同为禾本科植物，二者亲缘关系较近。由表2可知，ZmEXO70s蛋白在不同组中均有分布，数目较多的是F组和I组，分别含有8和6个;数目最少的是E组和H组，分别只有1个;I组中只包含ZmEXO70s和OsEXO70s蛋白，分别为6和16个;在亲缘关系较近的F组和I组中，ZmEXO70s与OsEXO70s蛋白数量相近，但明显多于AtEXO70s蛋白数量，其原因可能是十字花科植物进化为禾本科植物时水稻和玉米全基因组发生复制事件并保存下较多基因;H组中ZmEXO70s蛋白数量远少于AtEXO70s蛋白数量，其原因可能是H组中编码ZmEXO70s蛋白的基因在玉米全基因组复制事件中發生基因丢失现象（表2）。综上所述，ZmEXO70s蛋白在系统发育进化上较保守，玉米基因组复制事件可能发生在禾本科植物分化之后，且大部分编码ZmEXO70s蛋白的基因被保存，仅部分基因发生丢失。

2.3ZmEXO70基因结构与保守结构域分析结果

构建36个ZmEXO70s蛋白的系统发育进化树，如图2-A所示。36个ZmEXO70s分为9组，与表2一致。对ZmEXO70s基因结构进行序列结构分析，发现大多数基因不含有内含子，仅少数基因含内含子，且内含子数量不同，其中内含子数最多是ZmEXO70D1b基因，含15个内含子。为研究ZmEXO70s蛋白基序组成的多样性和保守性，利用MEME对其保守基序进行分析，结果如图2-B所示。36个ZmEXO70s蛋白共含8种基序（Motif1～Motif8），且各基序主要集中在基因的C端，示意ZmEXO70s蛋白C端序列具有较高的保守性。从基序种类来看，B组、D组和E组的ZmEXO70s蛋白保守性更高，包含全部基序，其他组ZmEXO70s在基序种类分布上存在明显差异，部分成员出现不同种类基序丢失现象，如ZmEXO70G1a蛋白只含有Motif1，ZmEXO70F2c蛋白只含有Motif3。此外，同一组内的ZmEXO70s蛋白含有不同基序，如ZmEXO70A2蛋白缺少Motif1、Motif2和Motif3，但ZmEXO70A1蛋白只含有Motif1、Motif2和Motif3;ZmEXO70F2b和ZmEXO70F2d蛋白只含有Motif2和Motif3，ZmEXO70F2c蛋白只含有Motif3。虽然8种基序的功能尚不明确，但通过Pfam分析保守结构域，结果显示Motif1～Motif8组成Exo70保守结构域（图2-C）。

已有研究证明EXO70蛋白C端含有多个高度保守且带有正电荷的碱性氨基酸，与带有负电荷的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸發生互作，促进胞泌复合体其他亚基募集至胞吐部位（Pe?enkováetal.，2022）。为此，本研究将ZmEXO70s蛋白C端可能与质膜脂质互作有关的氨基酸序列进行多重比对分析，结果如图3所示。与质膜脂质互作有关的氨基酸序列由65～75个氨基酸组成，包含11个碱性氨基酸（蓝色星号）和9个酸性氨基酸（红色星号），其中有多个氨基酸位点相对保守。除ZmEXO70A1、ZmEXO70G1a、ZmEXO70F2b、ZmEXO70F2c和ZmEXO70F2d不含该段氨基酸序列外，其余31个ZmEXO70s蛋白C端均含该段氨基酸序列。在11个碱性氨基酸中，除第1和10个碱性氨基酸以外，其余9个碱性氨基酸在ZmEXO70s蛋白中保守性较高。在9个酸性氨基酸中，除第1、5和6个以外，其余6个酸性氨基酸在ZmEXO70s中也具有较高的保守性。但目前对这些保守的酸性和碱性氨基酸在Exo70结构域中的功能尚不明了，猜测部分位点的氨基酸差异影响ZmEXO70s蛋白脂质结合能力，进而影响蛋白在细胞中的定位，或是ZmEXO70s蛋白功能差异的重要决定因素。

2.4ZmEXO70s基因在不同组织及非生物胁迫下的表达分析结果

利用玉米B73的RNA-Seq数据（Sekhonetal.，2022），对36个ZmEXO70s基因在15个组织中的表达特性进行分析，结果如图4-A所示。组间和组内的ZmEXO70s基因表达水平均存在明显差异，其中ZmEXO70A2、ZmEXO70F1a和ZmEXO70AF1b基因表达水平较高，其次是ZmEXO70B1、ZmEXO70B2a、ZmEXO70B2b、ZmEXO70D1a、ZmEXO70D1c、Zm-EXO70D2a、ZmEXO70D2b、ZmEXO70E1、ZmEXO70-F1a、ZmEXO70F1b、ZmEXO70F2a、ZmEXO70F2b、ZmEXO70G1b、ZmEXO70G1c和ZmEXO70G2等15个ZmEXO70s基因，表达水平也较高，猜测这些Zm-EXO70s基因是玉米生长发育中的重要调控基因;剩余基因的表达水平相对较低。值得注意的是，Zm-EXO70B3基因在雄穗、花药、叶片和花丝中高表达，ZmEXO70C1a基因仅在雄穗和花药中高表达，ZmEXO70D2b基因在胚乳和萌发种子中低表达，ZmEXO70G1c基因在花丝和萌发种子中低表达。

利用Li等（2022）的RNA-Seq数据（PRJNA244661和PRJNA335771）分析ZmEXO70s基因在干旱、高温、高盐和低温等非生物胁迫下的表达模式，结果如图4-B所示。在36个ZmEXO70s基因中，有23个ZmEXO70s基因至少可响应一种非生物胁迫，说明这些ZmEXO70s基因响应非生物胁迫，其余13个ZmEXO70s基因可能表达量极低，在RNA-Seq数据中未检测出。干旱胁迫下，ZmEXO70D1和ZmEXO70I2基因上调表达，ZmEXO70A1、ZmEXO70B3、ZmEXO-70D1a、ZmEXO70G1c和ZmEXO70I6基因下调表达。高温胁迫下，ZmEXO70s基因表现出不同的表达模式，如ZmEXO70D2b、ZmEXO70E1、ZmEXO70F2a和ZmEXO70F4基因上调表达，而ZmEXO70F1b、ZmEXO70H1和ZmEXO70I6基因下调表达。高盐胁迫和低温胁迫下，大多数ZmEXO70s基因被诱导上调表达，仅少数基因表达受到抑制，如ZmEXO70G1c和ZmEXO70H1基因在高盐和低温胁迫下均下调表达，ZmEXO70A1和ZmEXO70A1基因在低温胁迫下的表达微弱下调。猜测大多数ZmEXO70s基因在非生物胁迫响应过程中发挥重要调控作用。

2.5ZmEXO70s基因遗传变异与玉米苗期耐热性的关联分析结果

利用基因家族关联分析方法检测ZmEXO70s基因的遗传变异与玉米苗期耐热性是否关联。玉米苗期耐热性是以玉米3叶1心期植株经持续高温胁迫下植株存活率为衡量指标。首先对AM368群体ZmEXO70s基因进行SNP分析，结果如表3所示。有31个ZmEXO70s基因含SNP位点，平均SNP位点数为21个，其中以ZmEXO70F2a基因SNP位点数最多，达85个。随后采用2种统计模型来分析基因型与表型间的相关性，结果如图5所示。通过GLM分析发现，ZmEXO70D2a、ZmEXO70E1和ZmEXO70I2基因的遗传变异与苗期耐热性存在显著相关性（P≤0.01）。通过MLM分析发现，ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因分别有2个SNP位点与苗期耐热性呈极显著相关（P≤0.001，下同）。进一步分析发现，ZmEXO70E1基因的2个SNP位点位于其5"-非编码区（UTR）（图6-A）;ZmEXO70D2a基因的2个SNP位点位于其编码区（图6-B）。

3探讨

玉米是目前我国种植面积最大的作物。随着测序技术不断发展和玉米全基因组测序的完成，为玉米基因家族鉴定、功能基因挖掘及基因功能研究等提供极有利的先决条件。虽然现已证明不同植物中EXO70s蛋白参与细胞壁形成、细胞分泌和抗逆应答等重要细胞学过程（Sekere?etal.，2022;Kulichetal.，2022），但目前鲜见有关ZmEXO70s基因家族的研究报道。本研从玉米基因组中共鉴定出36个ZmEXO70s基因，说明EXO70s蛋白在玉米中与其他植物一样，均为多拷贝。植物EXO70s蛋白多拷贝现象可能是由于植物具有多种多样的细胞壁及繁杂的液泡结构，需要多种胞泌复合体满足其适应环境的需要，进而演化出不同基因特有的调控机制（Eliasetal.，2022;Chongetal.，2022）。ZmEXO70s基因家族成员数（36个）与高梁Ex070s（SbEXO70s）基因家庭数目（31个）相当，但比AtEXO70s基因家族成员数（23个）多，比OsEXO70s基因家族成员数（41个）少，可能是由于禾本科植物（水稻、玉米和高粱）在物种形成和进化过程中发生了全基因组复制和二倍体化，从而导致其EXO70s基因家族成员数目比十字花科的拟南芥多，且玉米和高粱在进化过程中经历染色体的丢失和融合，导致二者的EXO70s基因家族成员数目均比水稻少。

基因表达模式示意其所行使的生物学功能。已有研究说明，胞泌复合体负责将高尔基囊泡栓系到细胞质膜上，其基因缺失或突變均会导致其失去该生物学功能（Koumandouetal.，2022;Drdováetal.，2022）。本研究对36个ZmEXO70s基因在15个组织中的表达水平进行分析，结果显示大多数Zm-EXO70s基因在玉米组织中均有表达，猜测这些ZmEXO70s基因是玉米生长发育中重要调控基因，其中，ZmEXO70B3和ZmEXO70C1a基因在雄穗和花药中高表达。Li等（2022）也研究发现，AtEXO70C1基因在成熟花粉中高效表达，当其发生突变后会导致花粉管生长迟钝，花粉的传递效率下降。可见，植物EXO70s基因家族中部分成员可能参与调控植株花粉发育过程。此外，已有研究说明，囊泡运输相关蛋白通过参与非生物胁迫下的质膜修复增加植物对低温、高盐等非生物胁迫的耐受性（Yamazakietal.，2022;KimandBassham，2022;Drakakakietal.，2022），但针对胞泌复合体在非生物胁迫应答响应过程的功能研究较少。本研究通过分析ZmEXO70s基因在干旱、高温、高盐和低温等非生物胁迫下的表达模式，结果显示36个ZmEXO70s基因中有23个ZmEXO70s至少响应一种非生物胁迫，示意ZmEXO70s基因可能参与调控植物非生物胁迫响应过程，为进一步表明植物胞泌复合体功能的分子机制提供理论依据。

虽然玉米来源于热带，但仍对高温环境敏感，当气温超过35℃时，玉米植株整个生命周期（营养生长和生殖生长）均会受到影响（牛丽等，2022;Shietal.，2022;石江等，2022），如春播玉米在抽雄吐丝期、夏播青储玉米在幼苗出土期遭遇高温热害的问题在我国玉米生产上表现