第十三章免疫细胞分离及表面标志检测课件

第十三章免疫细胞分离及表面标志检测第十三章免疫细胞分离及表面标志检测1优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt2免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定※方法：体外法为主※目的：判断机体免疫状态※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或组织中分离出来3免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能第一节免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离第一节免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离4细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同细胞分离基本原理不同细胞密度不同5一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。

聚蔗糖-泛影葡胺聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripher6原理外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.075～1.090，红细胞和多核细胞分别为1.093和1.092，选择比重为1.077±0.001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。

原理外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.075～17用1.077±0.001的分层液可分离人外周血单个核细胞Ficoll分离液２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液１份34%泛影葡胺生理盐水溶液(聚蔗糖-泛影葡胺）Ficoll外周血用1.077±0.001的分层液可分离人外周血单个核细胞8一、T细胞表面标志及其亚群聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒与血浆和分离细胞不相溶；第十三章免疫细胞分离及表面标志检测淋巴细胞占９０％～９５％；CD4+CD25+调节性T细胞对分离介质的要求：对细胞无毒；E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离001的分层液可分离人外周血单个核细胞001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。对分离介质的要求：对细胞无毒；采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。对分离介质的要求：对细胞无毒；※目的：判断机体免疫状态组织中分离出来此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。对分离介质的要求：对细胞无毒；等渗；与血浆和分离细胞不相溶；有特定的比重。不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.085大鼠：1.087人：1.075～1.090一、T细胞表面标志及其亚群对分离介质的要求：对细胞无毒；不同9方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达９５％，淋巴细胞占９０％～９５％；操作简便；易于无菌。

方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达９５％，10二、淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱过滤法Percoll分离液法（连续密度梯度离心）二、淋巴细胞分离贴壁粘附法11利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞(无活性）。1.贴壁黏附法PBMC37℃°1hour上清液单核单核淋巴细胞注意：B细胞也可粘附利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬12利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。2.吸附柱过滤法PBMC洗脱洗脱液淋巴细胞单核细胞>DC>B细胞>T细胞细胞的粘附能力：利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入133.Percoll分离液法Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。死细胞血小板单核细胞淋巴细胞粒细胞红细胞3.Percoll分离液法Percoll是一种经聚乙烯14三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离磁性微球分离法荧光激活细胞分离仪分离法

三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离磁性微球分离法15大鼠：1.CD4+CD25+调节性T细胞等渗；E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵组织中分离出来（regulatoryTcell,TrorTreg）大鼠：1.SmIg：膜表面免疫球蛋白CD40（成熟B细胞）CD22和CD23CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞单核细胞>DC>B细胞>T细胞与血浆和分离细胞不相溶；（连续密度梯度离心）２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离人：1.利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。1.磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（Fe2o3,Fe3o4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。大鼠：1.1.磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（Fe2o16第十三章免疫细胞分离及表面标志检测课件17第十三章免疫细胞分离及表面标志检测课件18流式细胞分析仪2.荧光激活细胞分离仪分离法流式细胞分析仪2.荧光激活细胞分离仪分离法19E花环沉降法尼龙毛柱分离法T细胞和B细胞的分离E花环沉降法T细胞和B细胞的分离201.E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）B细胞T细胞Ficoll液离心溶解红细胞T细胞B细胞1.E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）B细胞212.尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。2.尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性22第十三章免疫细胞分离及表面标志检测课件23四、不同细胞分离方法的综合评价早期细胞物理属性细胞生物属性分辨率和灵敏度不高现在（根据细胞表面标志）免疫磁珠流式细胞仪分辨率和灵敏度高缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵四、不同细胞分离方法的综合评价早期细胞物理属性细胞生物属性分24五、分离细胞的保存和活力检测1.分离细胞的保存对保存液的要求等渗，具pH缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc199、RPMI1640）。如需短期保存，置4℃放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮罐中在深低温(196℃)条件下保存细胞。五、分离细胞的保存和活力检测1.分离细胞的保存252.细胞活力测定细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypanblue)染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数200个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。2.细胞活力测定用血细胞计数器在显微镜下观察到着色26一、T细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志的检测四、细胞表面标志检测的意义

三、自然杀伤细胞表面标志的检测

第二节淋巴细胞标志及亚群分类一、T细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志的检测四、细胞表面27一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8辅助性T细28不同细胞生物学特性不同001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。一、T细胞表面标志及其亚群荧光激活细胞分离仪分离法一、T细胞表面标志的检测对分离介质的要求：对细胞无毒；等渗；采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。090，红细胞和多核细胞分别为1.单核细胞>DC>B细胞>T细胞一、外周血单个核细胞分离不同细胞表面分化抗原不同※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定组织中分离出来001的分层液可分离人外周血单个核细胞此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt淋巴细胞占９０％～９５％；与血浆和分离细胞不相溶；如需短期保存，置4℃放置较好，可减低细胞代谢活动。大鼠：1.二、B细胞表面标志

SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。不同细胞生物学特性不同二、B细胞表面标志SmIg、Fc受体29CD19+CD5-:B2细胞SmIg：膜表面免疫球蛋白CD19（B细胞的标志）CD21CD32(FcRⅡ)CD35（C3b/C4b受体）CD40（成熟B细胞）CD80/86（活化的B细胞）CD19+CD5+:B1细胞CD22和CD23二、B细胞表面标志

CD19+CD5-:B2细胞SmIg：膜表面免疫球蛋白CD130三、NK细胞表面标志人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。三、NK细胞表面标志人类NK细胞表面标志主要以31一、外周血单个核细胞分离CD19（B细胞的标志）一、T细胞表面标志的检测E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）一、T细胞表面标志及其亚群一、T细胞表面标志及其亚群淋巴细胞占９０％～９５％；CD3+CD4+CD8辅助性T细胞２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液CD3+CD4+CD8辅助性T细胞优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt对分离介质的要求：对细胞无毒；与血浆和分离细胞不相溶；利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。四、细胞表面标志检测的意义CD40（成熟B细胞）对分离介质的要求：对细胞无毒；淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。一、外周血单个核细胞分离淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴32第十三章免疫细胞分离及表面标志检测第十三章免疫细胞分离及表面标志检测33优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt34免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定※方法：体外法为主※目的：判断机体免疫状态※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或组织中分离出来35免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能第一节免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离第一节免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离36细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同细胞分离基本原理不同细胞密度不同37一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。

聚蔗糖-泛影葡胺聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripher38原理外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.075～1.090，红细胞和多核细胞分别为1.093和1.092，选择比重为1.077±0.001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。

原理外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.075～139用1.077±0.001的分层液可分离人外周血单个核细胞Ficoll分离液２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液１份34%泛影葡胺生理盐水溶液(聚蔗糖-泛影葡胺）Ficoll外周血用1.077±0.001的分层液可分离人外周血单个核细胞40一、T细胞表面标志及其亚群聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒与血浆和分离细胞不相溶；第十三章免疫细胞分离及表面标志检测淋巴细胞占９０％～９５％；CD4+CD25+调节性T细胞对分离介质的要求：对细胞无毒；E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离001的分层液可分离人外周血单个核细胞001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。对分离介质的要求：对细胞无毒；采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。对分离介质的要求：对细胞无毒；※目的：判断机体免疫状态组织中分离出来此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。对分离介质的要求：对细胞无毒；等渗；与血浆和分离细胞不相溶；有特定的比重。不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.085大鼠：1.087人：1.075～1.090一、T细胞表面标志及其亚群对分离介质的要求：对细胞无毒；不同41方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达９５％，淋巴细胞占９０％～９５％；操作简便；易于无菌。

方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达９５％，42二、淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱过滤法Percoll分离液法（连续密度梯度离心）二、淋巴细胞分离贴壁粘附法43利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞(无活性）。1.贴壁黏附法PBMC37℃°1hour上清液单核单核淋巴细胞注意：B细胞也可粘附利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬44利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。2.吸附柱过滤法PBMC洗脱洗脱液淋巴细胞单核细胞>DC>B细胞>T细胞细胞的粘附能力：利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入453.Percoll分离液法Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。死细胞血小板单核细胞淋巴细胞粒细胞红细胞3.Percoll分离液法Percoll是一种经聚乙烯46三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离磁性微球分离法荧光激活细胞分离仪分离法

三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离磁性微球分离法47大鼠：1.CD4+CD25+调节性T细胞等渗；E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵组织中分离出来（regulatoryTcell,TrorTreg）大鼠：1.SmIg：膜表面免疫球蛋白CD40（成熟B细胞）CD22和CD23CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞单核细胞>DC>B细胞>T细胞与血浆和分离细胞不相溶；（连续密度梯度离心）２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液三、T、B细胞和T细胞亚群

的分离人：1.利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。1.磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（Fe2o3,Fe3o4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。大鼠：1.1.磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（Fe2o48第十三章免疫细胞分离及表面标志检测课件49第十三章免疫细胞分离及表面标志检测课件50流式细胞分析仪2.荧光激活细胞分离仪分离法流式细胞分析仪2.荧光激活细胞分离仪分离法51E花环沉降法尼龙毛柱分离法T细胞和B细胞的分离E花环沉降法T细胞和B细胞的分离521.E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）B细胞T细胞Ficoll液离心溶解红细胞T细胞B细胞1.E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）B细胞532.尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。2.尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性54第十三章免疫细胞分离及表面标志检测课件55四、不同细胞分离方法的综合评价早期细胞物理属性细胞生物属性分辨率和灵敏度不高现在（根据细胞表面标志）免疫磁珠流式细胞仪分辨率和灵敏度高缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵四、不同细胞分离方法的综合评价早期细胞物理属性细胞生物属性分56五、分离细胞的保存和活力检测1.分离细胞的保存对保存液的要求等渗，具pH缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc199、RPMI1640）。如需短期保存，置4℃放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮罐中在深低温(196℃)条件下保存细胞。五、分离细胞的保存和活力检测1.分离细胞的保存572.细胞活力测定细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypanblue)染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数200个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。2.细胞活力测定用血细胞计数器在显微镜下观察到着色58一、T细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志的检测四、细胞表面标志检测的意义

三、自然杀伤细胞表面标志的检测

第二节淋巴细胞标志及亚群分类一、T细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志的检测四、细胞表面59一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8辅助性T细60不同细胞生物学特性不同001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。一、T细胞表面标志及其亚群荧光激活细胞分离仪分离法一、T细胞表面标志的检测对分离介质的要求：对细胞无毒；等渗；采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。090，红细胞和多核细胞分别为1.单核细胞>DC>B细胞>T细胞一、外周血单个核细胞分离不同细胞表面分化抗原不同※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定组织中分离出来001的分层液可分离人外周血单个核细胞此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。