真核生物基因表达调控

EukaryoticGeneExpression

andRegulation第八章真核基因表达调控1编辑ppt本章主要内容基因表达与调控的基本概念与原理转录水平的调控(transcriptionalregulation):DNAlevel(Genetic)Chromatinlevel(Epigenetic)转录后水平的调控(post-transcriptionalregulation)：RNAinterference（RNAi）Proteindegradation（Ubiquitin/proteasome）2编辑ppt第一节

基本概念与原理BasicConceptsandPrinciples3编辑pptGenome(cell’srepertoireofDNA)Transcriptome(cell’srepertoireofRNAtranscripts)Proteome(cell’srepertoireofproteins)单个基因单个细胞中心法则4编辑ppt一、基因表达的概念基因组(genome)一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。基因表达(geneexpression)基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子或RNA分子的过程。基因表达调控(generegulation,orregulationofgeneexpression)

基因表达是受内源及外源信号调控的。5编辑pptRegulationofGeneExpressionChromatinepigeneticcontrolRNAsilencingProteindegradation一般而言的基因表达调控范畴6编辑ppt二、基因表达的时间性及空间性（一）时间特异性按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性(temporalspecificity)。多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stagespecificity)。7编辑ppt人体发育过程中不同类型β-珠蛋白的含量变化

8编辑ppt（二）空间特异性基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cellortissuespecificity)。在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性(spatialspecificity)。9编辑pptBARD1isexpressedspecificallyintheapicaldomainsof

Arabidopsisinflorescence(A),ovules(B),anthers

(C),andembryos(D).InsuithybridizationA,B,C,D:antisenseBARD1probe;E:senseBARD1probeasanegativecontrol.（朱玉贤第五章课件）10编辑ppt四种母源影响基因的mRNA和蛋白沿果蝇胚胎前-后轴分布的浓度变化图

proteinBICOIDNANOS第十章（基因和发育）mRNA11编辑pptFactsIdenticalgenome:VirtuallyeverycellinanorganismcontainsacompletesetofgenesSpatialspecificity:ButtheyarenotallturnedonineverycellortissueTemporalspecificity:EachcellofanorganismexpressesadistinctivesubsetofgenesatdifferenttimeordevelopmentalstageTight

regulation:Duringdevelopmentdifferentcellsexpressdifferentsetsofgenesinapreciselyregulatedfashion12编辑ppt三、基因表达的方式按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：（一）组成性表达(constitutiveexpression)某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeepinggene)。13编辑ppt这类基因表达又称为组成性基因表达(constitutivegeneexpression)。genesforessentialcellularstructuresandmetabolicpathways(e.g.rRNA,actin,tubulin)usuallyexpressedathighleveltheleveloftheirgeneexpressionmayvaryHousekeepinggenesrRNA,actin,tubulin

arecommonlyusedasloadingcontrolinRT-PCRorNorthernblot14编辑ppt（二）诱导和阻遏表达在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因(inducible

genes)。

如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因(repressiblegenes)。基因表达调控大多数是对这些基因的转录和翻译速率的调节,从而导致其编码产物的水平发生改变，影响其功能。15编辑ppt四、基因表达调控的生物学意义（一）维持细胞增殖、分化（二）维持个体生长、发育（三）适应环境变化第九、十章（基因与疾病、基因与发育）将要讲到16编辑ppt1.Transcripts（转录本）beginandendbeyondthecodingregion(5’UTRand3’UTR)2.Theprimarytranscriptisprocessedby: 5’capping 3’formation/polyA

splicing3.Maturetranscriptsaretransportedtothecytoplasmfortranslation一般而言，基因表达调控主要是发生在基因转录水平上的调节，即：mRNA合成的多少。transcription17编辑ppt五、基因转录调节基本要素（一）RNA聚合酶(RNAPolymerase)（二）特异DNA序列(cis-actingelements)（三）调节蛋白(trans-actingfactors)GeneexpressionregulationatthelevelofDNA

(transcriptionalregulation) --highlysequence-dependent --variedregulationfordifferentgenes18编辑pptcis-actingelements:promoters/regulatorysequencesofgenestrans-actingfactors:proteinsandRNAsthatbindcis-elementsandpromoteorrepressgeneexpression19编辑ppt

(一)RNA聚合酶启动子、调节序列和调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性。RNA

Pol

I:

rRNA,相对活性50-70%RNA

Pol

II:

mRNA,相对活性20-40%RNAPolIII:tRNA,相对活性10%RNAPolIV:smallncRNA,相对活性??20编辑ppt真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异DNA序列，称为顺式作用元件(cis-actingelement)。

顺式作用元件能够被转录调节蛋白特异识别和结合，从而影响基因表达活性。启动子(promoter)

顺式作用元件又分增强子(enhancer)沉默子(silencer)En/SiProDNA编码序列转录起始点

（二）特异DNA序列21编辑ppt反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白，统称为反式作用因子。按其功能不同，常有以下三类：

基本转录因子:识别promoter元件转录调节因子:识别enhancer或silencer共调节因子：不能进行DNA-蛋白质相互作用（三）真核基因的调节调节蛋白22编辑pptRNA聚合酶Ⅱ在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物polⅡTFⅡHTAFTFⅡFTAFTAFTFⅡATFⅡBTBPTATADNATAF:TBP

associatedfactorsholoenzyme1.基本转录因子(generaltranscriptionfactor,GTF)

是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合、并启动转录的一类调节蛋白。TBP:TATA-boxbindingproteinTFII:polIIassociatedTF23编辑ppt2.转录调节因子(transcriptionfactor,TF)

这类调节蛋白能识别并结合转录起始点的上游序列和远端的增强子元件，通过DNA－蛋白质相互作用而调节转录活性。决定不同基因的时间、空间特异性表达.

转录激活因子(transcriptionalactivator)

转录阻遏因子(transcriptionalrepressor)3.共调节因子(transcriptionalregulator/co-factor)首先与转录因子发生蛋白－蛋白相互作用，进而影响它们的分子构象，以调节转录活性,本身无DNA结合活性。如果与转录激活因子有协同作用——共激活因子；与转录阻遏因子有协同作用——共阻遏因子。24编辑ppt常见转录因子的结构域(domain)DNA结合域（DNA

binding

domain)BasicAA(K/R)rich,positivelycharged转录激活域(trans-activationdomain)TF蛋白质-蛋白质结合域（dimerization,co-factors）

谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域(D/E-rich)脯氨酸(P)富含域25编辑pptZincFingerbHLHbZIPHomeodomain1）TF最常见的DNA

bindingdomain26编辑ppt(1)锌指(zincfinger)常结合GC

boxCys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-HisC-terminal:α-helixbindingDNA27编辑ppt(2)碱性亮氨酸拉链bZIP28编辑pptbHLH蛋白(basicHelix-Loop-Helix)(3)碱性螺旋-环-螺旋bHLH29编辑ppt2）TF常见的trans-activationdomain30编辑ppt(Activationdomainisinterchangeable)31编辑pptInteractionAssaysDesignofTwo-hybrid/Three-hybrid/etc…separablefunctionaldomainsTwo-hybridassay(protein-protein)Tri-hybridassay(protein-RNA)32编辑ppt

1.

RNA

polymerase

II

2.

promoter

and

enhancers

3.

transcription

factorsEukaryoticgeneexpressionisusuallycontrolledatthelevelofinitiationof

transcription.真核基因转录起始的调控33编辑ppt

Holoenzyme---asupramolecularcomplexcomprisingPolII, mostGTFs,andMediator/SrbcomplexInyeast,a2MDaholoenzyme+TBPsufficesfortranscriptionOrderedAssemblyandPolIIHoloenzymeTFIIDTFIIDone-stepmultiple-step34编辑pptTFIIBbindstoDNAandcontactsRNA

polymeraseneartheRNAexitsiteandattheactivecenter,and

orientsitonDNA.+25bpQ:prok-10bpvseuk-25bp?SequentialAssemblyTBP:TATAbindingproteinTAFs:TBPassociatedfactorsBindingofTFIID(TBP+11TAFs,800KD)totheTATAboxisthefirststepininitiation.35编辑pptCTD：RNAPolIIC-terminaldomainCTDisanunusualextensionappendedtotheCterminusofthelargestsubunitofRNApolymeraseII.Itcomprisesfrom25to52tandemcopiesoftheconsensusrepeatheptadY1S2P3T4S5P6S7.S2andS5aremajorphosphorylationsites.CTDphosphorylationcausetheconversionofprolineisomerizationstates.PhosphorylationpatternsontheCTDrepeatsdeterminedifferentsetsofassociatedfactors,sothatprovideadynamicplatformtorecruitdifferentregulatorsofthetranscriptionapparatus.Ineukaryoticcells,thetranscriptionofgenesisaccuratelyorchestratedbothspatiallyandtemporallybytheC-terminaldomainofRNApolymeraseII(CTD).36编辑pptPIC:PhosphoS5isrequiredforassemblyofthePICandfacilitatesmRNAcappingviarecruitmentofcappingenzymes.Elongation:S5graduallybecomesdephosphorylated,whereasS2isphosphorylated.Terminating:PhosphoS2ensuresefficient3′-RNAprocessingbytriggeringrecruitmentof3′-RNAprocessingmachinery.Ending:CTDsarefreeofphosphategroups;non-phosphorylatedCTDsarerequiredforRNApolymeraseIItorecycleandbindapromoterforthenextcycleoftranscription.S2&S5,thetriggerfortranscriptionalprocessmodulation37编辑ppt38编辑pptFactorsinvolvedingeneexpressionincludeRNA

polymeraseandthebasalapparatus,activatorsthatbinddirectly

to,co-activatorsthatbind

tobothactivatorsandthebasalapparatus,andregulatorsthat

actonchromatinstructure(chromatinremodelingcomplex).ManyTranscriptionalActivatorsi.e.CAATGC-box39编辑pptNeartheinitiationsiteAlittlefaraway40编辑pptSP1stimulatestranscriptioninpresenceofTAFII110GCboxesboundbyDNAbindingproteinSP1SP1recruitsTFIIDbybindingTAFII110Partiallyreconstitutedcomplex(TBPand3TAFs)inadditionto otherGTFs,PolIIleadstohighlevelsoftranscription

SV40earlypromoterNear41编辑pptMediatorcomplexistargetedbyanactivatorMediatorisastablecomplexcontainingseveralproteins(20-50)MediatorbindstotheRNApolIIandtranscriptionfactors(activators orrepressors)and‘mediates’theregulatorysignalstopolII

(中介复合体）Far42编辑pptWhatisthemechanismofactivation?Twomodels:

Tetheringholoenzyme

(recruitment)Activatingholoenzyme(allosteric)(interactionactivation)??43编辑pptInfavorofrecruitment

model（勾引模型）44编辑ppttatproteinofHIVcanstimulate

transcriptioninitiationwithoutbindingDNAatall

TheactivatingdomainofthetatproteincanstimulatetranscriptionifitistetheredinthevicinityofpromoterbybindingtotheRNAproduct(tarsequence)ofapreviousroundoftranscription.tartat45编辑pptDNA-bindingdomainistobringtheactivationdomainintothevicinityofthestartpoint.

Andactivationisindependentofthemeansoftethering.wecanthinkofDNA-binding(orRNA-bindinginthecaseoftat)domainasprovidinga"tethering"function,whosemainpurposeistoensurethattheactivationdomainisinthevicinityoftheinitiationcomplex.Thenotionoftetheringisamoregeneralideathatinitiationrequiresahighconcentrationoftranscriptionfactorsinthevicinityofthepromoter.Thismaybeachievedwhenactivatorsbindtoenhancers,upstreampromoterelements,orinanextremecasebytetheringtoanewly-madeRNAproduct.46编辑ppt总结

所有激活因子的共性：识别靶位点（启动子、增强子）的特异性由DNA结合域决定。DNA结合域将转录激活域带到基础转录区域附近。

直接作用的激活因子具有DNA结合域和转录激活域。

没有转录激活域的激活因子可能与具有转录激活域的共激活因子一起行使功能。

基础转录区域中许多元件是（共）激活因子的靶位点RNA聚合酶可以和多种不同的转录因子相互作用，形成全酶复合物行使功能。47编辑ppt‘Synergy’

HighlevelsoftranscriptioninducedbymultiplefactorsTranscriptionfactorscanenhancetranscriptioninanon-linearmannerSynergisiticactivationoccursduetomultiplecontactswiththemachineryMultiplecopiesofthesameactivatoralsoinducesynergisticactivation48编辑pptInterferonßenhancerEnhancersoftenhavebindingsitesforseveraltranscription

factorsTranscriptionfactorscanbind

cooperativelyatadjacentsitesArchitecturalfactors(withnoregulatorydomains,i.e.HMG1)canassistassemblyRemarkablyincreasebindingaffinityforbothDNAandmachinery49编辑pptHMG1肩并肩、手挽手，根基稳、魅力足香肩并立、玉指紧扣，脚如磐石、面若桃花50编辑pptOnepossiblestrategy:----Looping----Cohesinshelptostabilizeenhancer-promoterinteractionsHowdoenhancersactindependentofdistanceandorientation?51编辑pptAnenhancermayfunctionbybringingproteinsintothevicinityof

thepromoter.Anenhancerdoesnotactonapromoterattheoppositeendofalong

linearDNA,butbecomeseffectivewhentheDNAisjoinedintoacirclebyaprotein

bridge.An

enhancerandpromoteronseparatecircularDNAsdonotinteract,butcan

interactwhenthetwomoleculesarecatenated.Twoexperimentssupporttheloopingmodel--Theessentialroleoftheenhanceris

toincreasetheconcentrationofactivatorin

thevicinityofthepromoter---52编辑pptReceptorsformanysteroidandthyroid

hormoneshaveasimilarorganization,withanindividualN-terminalregion,conservedDNA-bindingregion,anda

C-terminalhormone-bindingregionSteroidreceptorsaretranscriptionfactorsZinc

finger

TF53编辑pptGlucocorticoidsregulategenetranscriptionbycausingtheir

receptortotransportintothenucleusandbindtoanenhancerwhoseactionis

neededforpromoterfunction.ActivationofGlucocorticoidReceptor(GR)Nuclearshuttling54编辑ppt利用GR的特性构建可诱导表达融合蛋白系统DexamethasoneGRGRGRXXXDexamethasone（DEX）:地塞米松,氟美松(抗炎药)，合成的一种糖皮质激素；通过分子克隆的方法将GR和要研究的核蛋白X构建成融合蛋白，转基因到酵母、动物细胞或者植物中；不施加外源DEX时，融合蛋白与HSP90形成复合物，由于构象和空间位阻等原因，融合蛋白存在于胞质中，不能定位到细胞核；添加DEX时，DEX扩散入胞与GR相结合，融合蛋白改变构象后核定位信号暴露，即可入核行使功能；用以研究核蛋白的功能（包括转录因子）。55编辑pptActivationTaggingapproach

inplantsPlanttransformationmutantsscreeninglocateT-DNAinsertionsiteinArabidopsisgenome(how?)identifytherightgeneconferringmutantphenotype(how?)构建T-DNA序列，其中包括4倍重复的CaMV的35S增强字序列，4×35S元件可以大大增强相邻基因的转录；通过转基因的方法将T-DNA片段整合到植物基因组中；植物基因组上与T-DNA插入位点相近的基因表达量增高，即得到这个基因gain-of-function的转基因植物；56编辑pptXVE＝LexA的DNA结合域(X)＋VP16转录激活域(V)＋humanestrogenreceptor调控域(E)NPTII；转基因筛选标记OLexA-46：LexA操纵子＋CaMV35S基本启动子（而非增强子）

Achemical-inducibleactivationtaggingvectorpER16inplants

RB->LB:T-DNAfragment(可以插入到基因组中)其工作原理为：在G10-90启动子控制下，XVE融合转录因子组成型表达；当加入雌激素，雌激素和受体调控域（E）结合，导致XVE融合蛋白构象发生变化，并由细胞质转移进入核内；在细胞核内，XVE中的LexA

DNA结合域（X）特异识别LexA操纵子区（OLexA），VP16的转录激活域（V）激活