低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备和其化学结构

低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备和其化学结构分析答辩人：薛霖专业：食品科学与工程导师：赵雪教授2013年6月6日研究背景海带红外光谱分析硫酸根含量相对分子质量总糖研究背景海带活性抗凝血抗病毒增强免疫抗肿瘤抗血栓研究现状2对低分子量的岩藻聚糖硫酸酯的消化吸收、免疫活性和抗流感病毒神经氨酸酶抑制作用的比较研究很少3加工的海带中含有丰富的褐藻酸钠、碘以及甘露醇，而加工随之产生大量岩藻聚糖硫酸酯，往往都作为废弃物丢弃，造成了很大的资源浪费1

目前低分子量的岩藻聚糖硫酸酯的制备和应用的研究还相对较少，尤其是分子量对消化吸收及活性的比较研究鲜有报道研究意义熟悉海带岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺1对提取的粗糖进行化学分析2分离纯化提取的粗糖，再对其做比较分析3岩藻聚糖硫酸酯氧化降解，为动物实验做准备4

岩藻聚糖硫酸酯分离纯化、结构分析用冷水浸提法从海带中提取岩藻聚糖硫酸酯，为后面的分离纯化做好准备。对提出来的岩藻聚糖硫酸酯测定其总糖含量，单糖组成，硫酸根含量，红外光谱分析，相对分子质量和蛋白质含量。

对分离纯化后的岩藻聚糖硫酸酯测定其总糖含量，单糖组成，硫酸根含量，红外光谱分析，相对分子质量和蛋白质含量。对其进行自由基氧化降解，为安全、高效的抗血栓活性的岩藻聚糖硫酸酯的研究奠定基础。海带化学结构分析研究内容岩藻聚糖硫酸酯的制备大分子量的化学结构分析氧化降解制备低分子量1.海带岩藻聚糖硫酸酯提取工艺实验方法1235462.海带化学结构分析总糖含量——苯酚—硫酸法相对分子质量——凯高效液相色谱法硫酸根含量——离子色谱法单糖组成——柱前衍生高效液相色谱法红外光谱分析——Nicolet-Nexus470傅立叶变换红外光谱仪蛋白质含量——folin酚法2.海带岩藻聚糖硫酸酯的化学分析实验结果1.总糖含量根据线性回归方程测定所提取的海带多糖总糖含量约为66.7%。

以岩藻糖为标准品，采用硫酸—苯酚法制作标准曲线，根据线性回归方程计算所提取的海带多糖总糖含量。2.海带岩藻聚糖硫酸酯的化学分析实验结果2.相对分子质量上图为海带岩藻聚糖硫酸酯的液相色谱图，分子量分布较广，范围为5.4K-735K，重均分子量为698.7KDa，分布系数为4.24。选用Agillent1100高效液相色谱仪；色谱柱:TSK-gelG4000PWxl（7.8×30cm）；检测器:示差检测器（G1362ARID）；流动相:0.2mol/LNaCl;流速:0.5mL/min；柱温:0℃；

实验结果3.硫酸根含量

以为标准品，配制溶液，采用离子色谱法，制作硫酸根标准曲线，根据线性回归方程及离子色谱谱图分析计算得样品中硫酸根含量。根据线性回归方程及离子色谱谱图分析计算得到样品中硫酸根含量约13.27%。2.海带岩藻聚糖硫酸酯的化学分析2.海带岩藻聚糖硫酸酯的化学分析实验结果4.单糖组成选用Agilent1100高效液相色谱仪，ZORBAXEclipse色谱柱XDB-C18分离柱（4.6×250mm，5μm）；245nm紫外检测器(DAD)；流速为1.0mL/min；保持柱温为25℃；流动相A：10%(V/V)乙腈+0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲液(pH5.5)；流动相B：25%(V/V)乙腈+0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲液(pH5.5)；时间梯度：0→40min，浓度梯度：40%→100%，流动相B。每次的进样体积设定为10μL。实验结果5.红外光谱分析2.海带岩藻聚糖硫酸酯的化学分析

由图分析得：在3447左右有很强的糖的羟基(O-H)伸缩振动吸收峰，2924左右有C-H的伸缩振动吸收峰，1635处有C=O的伸缩振动吸收峰，1411处有C=O的对称伸缩振动峰，1259附近有较强的S=O的对称吸收峰，819处的吸收峰是C—O—S伸缩振动峰，它的位置与硫酸根在糖上的位置有关，表明硫酸根主要连接于糖的C2和C3位。实验结果6.蛋白质含量2.海带岩藻聚糖硫酸酯的化学分析根据标准曲线的方程计算出海带多糖中蛋白质含量约为15.28%±0.52%。以牛血清白蛋白BSA为标准品，制作标准曲线，根据方程计算海带多糖中蛋白质含量。实验方法12343.海带岩藻聚糖硫酸酯的分级纯化及纯化后的化学分析阴离子交换色谱分级纯化总糖含量——苯酚—硫酸法硫酸根含量——离子色谱法法单糖组成——柱前衍生高效液相色谱法实验结果1.

岩藻聚糖硫酸酯的梯度洗脱3.海带岩藻聚糖硫酸酯的分级纯化及纯化后的化学分析

在岩藻聚糖硫酸酯的各级洗脱液中，由1.5mol/L氯化钠溶液洗脱得到的组分含糖量最高。

将粗岩藻聚糖硫酸酯通过Q-SepharoseFF阴离子交换色谱（5.8*30cm），分别用0、0.5、1.0、1.5、2.0mol/LNaCl溶液分步洗脱，用硫酸－苯酚法检测洗脱液的含糖量直到糖完全洗脱完毕。弃去H2O洗脱部分，分别收集其余组分。用截留分子量为1kDa的中空纤维超滤膜进行超滤脱盐，然后分别浓缩冻干，测定各组分的单糖组成、总糖含量和硫酸根含量。实验结果2.总糖含量3.海带岩藻聚糖硫酸酯的分级纯化及纯化后的化学分析实验结果3.硫酸根含量3.海带岩藻聚糖硫酸酯的分级纯化及纯化后的化学分析实验结果4.不同分子量组分单糖组成的比较3.海带岩藻聚糖硫酸酯的分级纯化及纯化后的化学分析4.

岩藻聚糖硫酸酯氧化降解检测指标14岩藻聚糖硫酸的氧化降解对迟发型变态反应的影响分子量的测定一高效液相色谱法（HPLC）的影响对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响4.

岩藻聚糖硫酸酯氧化降解实验结果1.岩藻聚糖硫酸的氧化降解

采用2.5%过氧化氢降解高分子量岩藻聚糖硫酸酯，可以使岩藻聚糖硫酸酯的分子量迅速下降，分子量由原来的20万左右，在1h、2h、3h的保留时间依次为18.233,14.136,13.639min，其重均分子量分别为42717Da、22484Da和10221Da。其硫酸根含量由24.80%上升到33.2%。4.

岩藻聚糖硫酸酯氧化降解实验结果

低分子量岩藻聚糖硫酸酯的单糖组成分析*所有单糖总和为100%。4.

岩藻聚糖硫酸酯氧化降解实验结果2.低分子量岩藻聚糖硫酸酯红外光谱采用Agilent1100高效液相色谱仪，选用TSK-gelG3000PWxl色谱柱（TosohBioscience）；用0.2mol/L的NaCl作为流动相；洗脱速度为0.5mL/min；保持柱温40℃，采用示差检测器（G1362A）。4.

岩藻聚糖硫酸酯氧化降解实验结果

4.

岩藻聚糖硫酸酯氧化降解实验结果

比较红外光谱分析图4-1发现，中分子量岩藻聚糖硫酸酯组分F-1和F-2有共同的糖特征峰，在3447cm-1处有强吸收，为O-H伸缩振动峰；2942cm-1为C-H伸缩振动峰，图中出现弱吸收，是岩藻糖甲基的吸收峰；1683cm-1处有强吸收峰，为结合水中的O-H官能团，1468cm-1处的吸收峰表示C=O的对称伸缩振动，说明组分中含有一定量的糖醛酸；1252cm-1附近的强吸收峰是S=O对称伸缩振动特征峰，1055cm-1附近是C-O弯曲振动和O-H的变形振动的强吸收峰，841cm-1处的吸收峰表示C-O-S伸缩振动，表明组分含有硫酸化多糖，进一步实验证实这两个组分均有硫酸基取代。本章小结低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备和其化学结构分析成功的从海带中提取了海带岩藻聚糖硫酸酯。对没有分离纯化的海带岩藻聚糖硫酸酯进行了较详细的化学结构分析。对提取的海带岩藻聚糖硫酸酯进行了分离纯化，并检测了各组分的总糖含量，硫酸根含量，相对分子量，红外光谱分析和蛋白质含量的测定。岩藻聚糖硫酸酯氧化降解，并做了化学分析，为以后的动物实验