层析技术 修改

实验：氨基酸分配纸层析层析缸层析液层析纸赖苏脯X苯分配层析原理：不同氨基酸分配系数不同，随流动相迁移速度不同，层析后留在不同位置。通过已知氨基酸可鉴定出待测氨基酸。分配系数（α）=溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶剂系统：正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5固定相：结合到滤纸上的水。流动相：推动被分离组分向前移动的溶液正丁醇。流动相依靠毛细作用向上移动。第一章层析技术1.定义2.分类第一节技术简介根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下：层析技术分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析吸附层析层析技术纸层析柱层析薄层层析离心薄层层析高效液相层析高效气相层析层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。3常用术语：（1）固定相（2）流动相（3）洗脱体积（Ve）指某一成分从柱顶部洗脱开始到在底部洗脱液中出现浓度最大值时所用的洗脱液的体积。指在层析过程中推动被分离物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析时，流动相又称为洗脱剂，即推动有效成分或杂质向一定方向移动的溶液。在薄层层析时，流动相又称为展开剂。是由层析基质组成的，它包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液）。这些物质能与有关化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。第二节离子交换层析一、技术方法过程②洗脱：pH梯度洗脱；或离子强度梯度洗脱③检测、记录分部收集。离子交换剂检测器记录仪泵入茚三酮分部收集层析柱①上样；不同氨基酸（蛋白质、酶、蛋白激素等）等电点不同，在同pH条件下带电性能不同，与交换剂结合力大小不同，结合较松的先被洗脱出来，结合较紧的后被洗脱出来，从而被分开。二、离子交换分离基本原理1.分离原理阳离子交换剂交换原理：RC-C1++C2+RC-C2++C1+RC-是带负电荷的交换剂，-C1+相当于可被交换的阳离子，在层析柱子上样前-C1+假设是Na+离子，而上样后带正电荷的各种蛋白质可替代Na+而结合在交换剂上，但不同蛋白质与交换剂结合的紧密程度不同，而当用洗脱剂洗脱时，洗脱剂中的阳离子又替代交换剂上的蛋白质。不同蛋白质向下移动快慢不同，从而按照先后顺序从柱子下端随洗脱剂流出，不同蛋白质进而被分开。2.交换剂类别阳离子交换剂阴离子交换剂(1)磺酸型;(2)含苯酚的磺酸型(3)羧酸型二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)

装柱：装填均匀，松紧一致，没有气泡，没有裂缝第三节离子交换层析过程中的关键技术一、交换剂处理二、柱子选择与装柱三、上样要求四、洗脱剂五、洗脱速度离子交换剂阳离子离子阳离子离子强酸型乙基磺酸纤维素SE磷酸纤维素P甲基磺酸纤维素SM-O-CH2-S-O－==OO-O-CH2-CH2-S-O－==OOO-O-CH2-O-P-O－==O弱酸型羧甲基纤维素CM-O-CH2-C-O－=O强碱型弱碱型三乙基氨TEAE基纤维素二乙基氨基DEAE乙基纤维素-O-CH2-CH2-N+-C2H5C2H5C2H5-O-CH2-CH2-N+-HC2H5C2H5类型交换剂的名称缩写活性基团层析柱洗脱液记录仪分部收集器核酸蛋白检测仪检测记录上样洗脱1原理：在凝胶颗粒所构成的立体的网状结构中，蛋白质的分子颗粒越大，受到凝胶颗粒的排阻越大，下行越快，优先洗脱出来；分子颗粒越小受到的排阻越小，阻力越大，洗脱出来的速度越慢。二凝胶过滤色谱(又称分子筛法)凝胶2常用凝胶：(1)天然凝胶：琼脂糖凝胶(2)人工合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶葡聚糖凝胶其商品名称Sephadex，根据需要可选用G-75（Mr分级范围1000-50000），G-100（5000-100000）等型号的凝胶。其中G后面的数据为得水值，即每g干胶吸水毫升再乘以10.

葡萄糖凝胶的规格与性质型号干颗粒直径(目)分子量分级范围得水值（ml/g）床体积（ml/g干胶）溶胀时间（h）操作压（2.5cm直径柱）/kPa20~25（℃）90~100（℃）肽及球形蛋白多糖SephadexG-25粗50~100中100~200细200~400超细﹥4001000~5000100~50002.5±0.24~631SephadexG-75中100~200超细﹥4003000~700001000~500007.5±0.512~152433.92~15.86SephadexG-100中120~200超细﹥4004000~1500001000~10000010.0±0.115~204852.35~9.41SephadexG-200中120~200超细﹥4005000~8000001000~20000020.0±0.230~407250.39~1.573应用：(1)分离、纯化与鉴定；(2)测定相对分子质量；(3)脱盐。三亲和层析1原理：利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。2应用：酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受体。层析柱亲和剂四吸附层析1原理：利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离溶剂中的溶解度差异进行分离，取决于物质的分子结构。2分类：(1)物理吸附，如：活性炭；(2)化学吸附，如：氧化铝；(3)交换吸附，如：硅胶。思考题：1.什么叫层析技术？常用的层析技术有哪些？2.指出常用层析技术的应用范围。3．SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？4.用SephadexG25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？5.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为什么？6.将分子量分别为a（90000）、b（45000）、c（110