第三章病毒感染力的滴定2013

第三章病毒感染力的滴定半数致死量LD50（50%lethaldose）半数感染量ID50(50%infectivedose)半数鸡胚致死量ELD50(egg50%lethaldose)半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose)半数细胞培养物感染量TCID50（tissueculture50%infectivedose)蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）测定病毒感染力的方法:将病毒作一定梯度的连续稀释后接种于实验动物或鸡胚或培养细胞，每一稀释度作多个重复，在一定时间内，记录动物（鸡胚）发病或死亡的数量或细胞病变的情况，利用Reed-Muench法或Karber法计算病毒的感染力。测定病毒感染力的基本过程:一、病毒TCID50的测定操作步骤在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100µl。在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到3×105个/ml。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法10-110-210-310-410-510-610-710-8TCID50的计算方法（CalculationofTCID50）病毒液出现无CPE累计出现CPE孔稀释度

CPE孔数孔数CPE孔数无CPE孔数所占的%10-180510100（51/51）

10-280430100（43/43）

10-380350100（35/35）

10-480270100（27/27）

10-580190100（19/19）

10-67111191.7（11/12）

10-7354640（4/10）

10-8171137.1（1/14）

1、Reed-Muench法CPE：Cytopathiceffect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.7-50）/（91.7-40）＝0.8lgTCID50=距离此例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数

=0.8×(-1)+(-6)=-6.8TCID50=10-6.8／0.1ml含义：将该病毒稀释106.8倍接种96孔细胞培养板，每孔100µl，可使50%接种孔的细胞发生病变。

2、Karber法病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率

10-188/8=110-288/8=110-38

8/8=110-488/8=110-58

8/8=110-67

7/8=0.87510-73

3/8=0.37510-811/8=0.125lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高浓度的稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(6.375-0.5)=-6.875TCID50=10-6.875/0.1ml二、病毒蚀（噬）斑技术病毒蚀斑（plaque)

又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：适当稀释的病毒悬液接种已经长成单层的敏感细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后，只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局限性的病灶。plaquesProcedures操作步骤将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层吸弃培养液，加入含钙、镁的PBS（pH7.4）洗1-2次。用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜，每个稀释度接种2-3孔。（一）用琼脂糖覆盖，中性红染色将培养板置37℃5%CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液，用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃，与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红DMEM混合，注入细胞培养板中。室温放置直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃5%CO2培养箱继续培养。每天于显微镜下观察细胞病变情况。出现空斑后（2-3天），用含钙、镁的PBS将0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细胞培养板上。于37℃5%CO2培养箱中作用1h，吸弃染液，继续于温箱中培养2-3h。TK-突变株与野毒形成的空斑的比较（二）用甲基纤维素覆盖，结晶紫染色将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层。吸弃培养液，加入含钙、镁的PBS（pH7.4）洗1-2次。用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜，每个稀释度接种2-3孔。将培养板置37℃5%CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液，用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。覆盖配好的4%羧甲基纤维素钠（含3%新生牛血清）。48-72h后，待细胞出现病变或蚀斑时，各孔补满10%中性甲醛，固定4h以上。弃掉孔中液体，流水侧板冲洗数次。各孔补加配好的结晶紫溶液（0.35%、w/v），作用15min。弃掉染液，继续冲洗数次，在37℃温箱中敞口烘干，显微镜下计空斑数。蚀斑技术的应用：用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株测定病毒悬液中感染病毒的含量如果是作病毒纯化

挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，接种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板，再于37℃5%CO2培养箱培养至完全发生病变。一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，通过PCR或其它方法进行鉴定，并测定TCID50，然后选TCID