神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究-儿科学(小儿外科)专业毕业论文

神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·中文摘要神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究中文摘要研究背景神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是4,A最常见的恶性实体肿瘤之一，占儿童期肿瘤的8～10％，其恶性程度高，多数患儿最终愈后不良，故深入研究NB的发生、开展机理至关重要。我们课题组在对NB的发生、开展机理进行研究时发现：雌激素(estrogen，E)和环境雌激素双酚A(bisphcnolA，BPA)均能促进神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株的增殖、侵袭和转移，即E和BPA均可促进NB的开展。在此根底上，我们试图探寻E和BPA对NB起始环节的作用，而肿瘤干细胞(cancerstemcell，csc)即属于肿瘤的起源细胞，故我们选择研究“E和BPA对神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株的CSC的影响一来探寻“E和BPA对NB起始环节有无作用"。研究目的SP(sidcpopulation，SP)分析法从神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株中别离并鉴定出CSC，明确E和BPA干预对SK-N．SH细胞株的CSC有无影响，最终了解E和BPA对NB的起始环节有无作用。材料与方法一、SK-N．SH细胞株侧群细胞的检测及检测条件的优化：不同的Hoechst孵育时间、不同的维拉帕米浓度检测SK-N．SH细胞株的SP细胞(侧群细胞)比例，根据SP细胞的检测效果选择各自的最正确条件；不同浓度Hoechst染色后的表型观察、CCK．8活细胞数评定了解Hoechst对SK-N．SH细胞株的毒性；不同浓度Hoecllst染色后的流式细胞仪细胞周期分析、AnnexinV．FITC和PI双标法流式细胞仪凋亡及死亡分析、再培养后SP细胞比例的检测，探讨Hoechst对SK-N．SH细胞株毒性的机理；最后比照不同浓度Hoechst对SK-N．SH细胞株的SP细胞检测效果，选择出能有效检测SP细胞并最低毒性的Hoechst浓度。二、SK-N．SH细胞株侧群细胞的分选及其干细胞特性的鉴定：流式细胞仪于SK-N．SH细胞株中分选出SP细胞和非sP细胞(NSP细胞)；SP和NSP细胞均分别接种于正常生长培养基和干细胞培养基中培养并传代，观察细胞表型的变化；电镜观察SP和NSP细胞的超微结构；免疫荧光和免疫印迹法了解SP和NSP细胞的干细胞和分化细胞标志物的表达；CCK．8分析了解SP和NSP细胞的增殖能力；连续培养的SP和NSP细胞的表型观察、蛋白标志物表达及流式细胞仪SP细胞比例再检测了解各细胞亚型的分化潜能；平板克隆实验、神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究博士论文·中文摘要Transwell侵袭实验、裸鼠成瘤实验明确SP和NSP细胞的恶性程度。三、雌激素和双酚A对SK-N．SH细胞株侧群细胞作用的研究：E2和BPA干预后流式细胞仪检测SK-N．SH细胞株的SP细胞比例；E2和BPA干预后免疫印迹法检测干细胞标志物c．kit和ABCG2蛋白的表达；CCK．8分析和流式细胞周期分析确认E2和BPA对SK．N—SH细胞株的促增殖作用；CCK．8分析了解E2和BPA对SK-N．SH细胞株的SP和NSP细胞各亚型的促增殖作用。结果一、SK-N—SH细胞株侧群细胞的检测及检测条件的优化：60min的Hoechst孵育时间、501xmol／L的维拉帕米浓度可有效于SK-N．SH细胞株检测出SP细胞；SK．N—SH细胞株特异地对低浓度的Hoechst毒性反响敏感，其机理与Hoechst干扰细胞周期、诱导细胞死亡和凋亡有关；比照不同浓度Hoechst的检测效果和毒性，最终选择59M的浓度用于SK-N．SH细胞株的SP细胞分选；以上述的检测条件检测出SK-N．SH细胞株的SP细胞比例为3．6±0．2％。二、SK-N—SH细胞株侧群细胞的分选及其干细胞特性的鉴定：成功于SK-N—SH细胞株中分选出SP和NSP细胞；SP细胞胞体小、有神经丝样突起，贴壁能力弱、集聚性生长，核质比高、胞浆细胞器少，高表达干细胞标志物、低表达分化细胞标志物，增殖速度快，具有快速分化能力，克隆形成能力强、侵袭性高、裸鼠成瘤率高；SK-N—SH细胞株的NSP细胞胞体大、无神经丝样突起，贴壁能力强、单层生长，核质比低、胞浆细胞器多，低表达干细胞标志物、高表达分化细胞标志物，增殖速度慢，具有缓慢的分化能力，克隆形成能力消失、侵袭性弱、无裸鼠成瘤能力。三、雌激素和双酚A对SK-N．SH细胞株侧群细胞作用的研究：E2和BPA均能使SK-N．SH细胞株的sP细胞比例下降直至检测不出、均能下调干细胞标志物c—kit和ABCG2蛋白的表达；E2和BPA均对SK-N—SH母细胞有显著的体外促增殖作用，但对其NSP细胞亚型的促殖作用较对其SP细胞亚型更显著。结论1．SP细胞研究时要警惕Hoechst的毒性，对任一将行SP细胞研究的新细胞株，SP细胞检测、分选的系列条件均应予优化以寻及最正确检测条件。2．SK-N．SH细胞株的SP细胞有CSC的特征。3．E2和BPA对SK．N．SH细胞株中具有干细胞特性的SP细胞的作用较对其NSP细胞小，故E2和BPA对NB的发生相对作用不大。关键词：神经母细胞瘤；SK．N．SH细胞株；Hoechst33342；侧群细胞；肿瘤干细胞；1713．雌二醇；双酚A中图分类号：R72神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文-英文摘要Identificationofstemcell-likepropertiesforsidepopulation(SP)cellsofneuroblastomaandeffectsofestrogenandbisphenolAontheSPcellsAbstractBackgroundsNeuroblastoma(NB)isacommonmalignantpediatrictumorandaccountsfor8-10％ofchildhoodCancers．Long-termsurvivalinhigh-riskcasesisstilllessthan50％incurrenttreatmentstrategies，thusresearchonthegenesisandprogressofNBisurgentlyneededtoimprovetreatment．OurresultsofresearchonthegenesisandprogressofNBshowedthatestrogen(E)andbisphenolA(BPA)whichisthemostcommonenvironmentalestrogennotonlypromotedthegrowthbutalsoimprovedtheinvasionandmetastasisforhumanNBSl洲·SHcells，i．e．EandBPApromotetheprogressofNB．OnthebasisofourresearchresultsforNB，wepresumethatEandBPAmaybecontributestothegenesisofNB．Itiswellknownthatcancerstemcells(csc)aretheorigincellsoftumors，thusweinvestigatetheeffectsofEandBPAontheCSCsofSK-N—SHcellsinordertoidentifyifEandBPAhaveatumorigenicabilityforNB．PurposeTheaimofthisstudyWastosortthesidepopulation(SP)cellsfromSK-N-SHcelllineandidentifyifthesortedSPcellshavetheCanCerstemcell-likeproperties．Atlast，theeffectsofEandBPAontheSPcellswereinvestigatedtounderstandifEandBPApromotethegenesisofNB．MaterialsandMethods1．ThedetectionofSPcellsinSK-N-SHcelllineandoptimizationofthedetectingprocedure：ThecomparisonofdetectingeffectforSPcellsbydifferentincubatingtime，differentconcentrationsofverapamilwasperformedtoselectthesuitableincubatingtimeandverapamilconcentration．Morphologyobservationandcellcountingkit-8(CCK-8)assayforre-culturedcellsfollowingdifferentconcentrationsofHoechstexposurewerecarriedouttoconfirmthetoxicityofHoechsttoSK-N—SHcells．Flowcytometryanalysisforcellcycle，AnnexinV-FITCandpropidiumiodidestainingflowcytometry，anddetectionoftheSPcellsforre．culturedcellsfollowingdifferentconcentrationsofHoechstexposurewereusedtoinvestigatethetoxicitymechanismofHoechsttoSK-N—SHcells．TheeffectiveandrelativelynontoxicconcentrationofHoechstforSPanalysisinSK-N—SHcells4神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·英文摘要wasselectedbycomparingtheSPcellsdetectingeffectandcytotoxicityofdifferentconcentrationsofHoechst．2．ThesortingofSK-N—SHSPcellsandidentificationfortheircancerstemcell-likecharacteristics：SPandnon-SP(NSP)cellswereseparatedfromtheSK-N—SHcelllinebyflowcytometryandculturedinnormalgrowthmediumorserum-freemediumcontainingsomegrowthfactors，andthentheircharacteristicswereanalyzedbylightandelectronmicroscopyformorphology；wealsousedwesternblottingtoanalyzemarkerproteins，CCK·8assayforproliferativeability,seriesdifferentiationassaysfordifferentiationproperties；singlecellcloneexperiment，Matrigelinvasionassaysandtumorigenicityassayswereperformedtoanalyzetheirmalignantpotential．3．TheresearchoftheeffectsofEandBPAontheSK-N．SHSPcells：FollowingbyE2orBPAexposure，thedetectionofSPcellswasperformedbyflowcytometry，andtheexpressionofstemcellmarkerproteinsC-kitandABCG2wasanalyzedbywesternbloting．Thegrowth—promotingeffectofE2orBPAonSK-N_SHparentcellsWasconfirmedbytheCCK一8assayandflowcytometrycellcycleanalysis．111eSK-N-SHSPandNSPsub—typesweretreatedbyE2orBPA，respectively，andthenthenumberofviablecellsforthesetwosub．typeswasevaluatedbyCCK-8assay．Results1．ThedetectionofSPcellsinSK-N．SHcellsandoptimizationofthedetectingprocedure：Tlleincubationtimeof60minute，theverapamilconcentrationof50v,mol／LaresuitabletodetecttheSPcellsinSK．N．SHcellline．SK．N．SHcellshadstrongtoxicreactiontoHoechstevenatlowerconcentrations．ThemechanismofthestrongHoechstsensitivityofSK．N-SHcellsrelatestotheperturbationofcellcycle，theacutecelldeathandapoptosisinducedbyHoechst．WeultimatelyselectedtheHoechstconcentrationof5HMtocarryouttheSPanalysisforSK-N．SHcelllineafterwecomparedtheSPcellsdetectioneffectandcytotoxicityofdifferentHoechstconcentrations．2．nesortingofSK-N-SHSPcellsandidentificatiONfortheircancerstemcell-likecharacteristics：WesuccessfullysortedtheSPandNSPcellsfromSK-N．SHcellline．SPcellsaresmall，haveneurites，growasclumpsofcellswithweaklysubstrate。adherent，andhavefewcytoplasmicorganellesandhi．曲nuclear—cytoplasmicratio；SPcellsexpresshighlevelsofthestemcellmarker5神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究博士论文·英文摘要proteinC-kit，havehi曲proliferativeandmalignantability,andhaveacapacityforfastdifferentiation．NSPcellsarelargeandflat,donothaveneurites，growasacontact-inhibitedmonolayer、)l，itlltightlysubstrate-adherent,andhavemanycytoplasmicorganellesandlownuclear-cytoplasmicratio；NSPcellsexpressthedifferentiatedcellmarkerproteinsperipherinandS100athighlevels，haveslowdifferentiateabilityandhavelowproliferativeandmalignantability．．3．11leresearchoftheeffectsofEandBPAontheSK．N—SHSPcells：BothE2andBPAgraduallydecreasesthepercentageofSPcellsinSK二N·SHcelllinetothelevelthatCannotbedetectedbyflowcytometryanddepressestheexpressionofthestemcellmarkerproteinsC-kitandABCG2．BothE2andBPAsignificantlypromotesgrowthnotonlyforSK二N—SHparentcellsbutalsoforitSSPandNSPsub-types，butthegrowth-promotingeffectofE2andBPAforNSPcellsissignificanthigherthanforSPcells．Conclusions1．Itisessentialtominimizeor,attheveryleast，beawareofHoechsttoxicityillSPanalysis．ThedetectingprocedureofSPcellsneedstobecarefullyoptimizedforeachnewcelllinestudied．2．SK-N—SHSPcellshavecancerstemcell—likeproperties．3．E2andBPAhavelowereffectsOntheSPcellswhichaleenrichedfortheorigincellsoftumor,thusE2andBPAmaybedon’thavethecapacitytopromotethegenesisofNB．KeyWords：neuroblastoma；SK-N—SHcellline；Hoechst33342；sidepopulation；CanCerstemcells；1713一estradiol；bisphenolAChineseLibraryClassifieation：R726英文缩写索引英文缩写索引Abbreviation(按首写字母排序)AV absorbancevalue 光吸收度值bFGF fibroblastgrowth 碱性成纤维细胞生长因factor—basic ；BPA bisphenolA 双酚ACSCcancerstemcell肿瘤干细胞DMS0dimethylsulphoxide二甲基亚砜Eestrogen雌激素E2 1713一estradiol 1713一雌二醇EE environmentalestrogens 环境雌激素EGF epidermalgrowthfactor 表皮生长因子ER estrogenreceptor 雌激素受体Hoechst Hoechst33342 烟酸己可碱ICI ICI182，780(fulvestrant) 氟维司群NB neuroblastoma 神经母细胞瘤NSP non-sidepopulation 非侧群细胞PI propidiumiodide 碘化丙啶PLI proliferationindex 增殖指数SP sidepopulation 侧群细胞神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究博士论文·前言前言神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是小儿最常见的恶性实体肿瘤之一，是起源于神经嵴的胚胎性肿瘤，发生于交感神经系统所在部位，以。肾上腺髓质最常见【l，2】。NB的恶性程度高，约70％初次确诊的患Jt,I≥H可见远处转移[2,31。不幸目前对NB确实切发病机理仍不清楚，在根底研究领域，虽然有新的研究方法介入，如基因芯片、小RNA干扰、蛋白质组学等，但也未取得明显突破；在临床治疗领域，虽然随着综合治疗如手术前的放化疗、化疗加用造血干细胞移植等措施的实行，但NB的治愈率也没有明显提高，可见深入研究NB的发病机理从而提供全新的治疗方案是治愈这--d,JL难治性肿瘤所急需的。我们课题组也在对NB的发生、开展机理进行研究并已取得一定的成果。我们选择的研究方向是：雌激素(estrogen，E)和环境雌激素(environmentalestrogens，EE)对NB发生、开展机理的研究【3巧J。E与肿瘤的关系是一个研究热点。人们早就认识到E与其靶器官如乳腺、子宫的肿瘤发生关系密切【6J，后来研究发现E与一些非E靶器官的肿瘤，如消化道肿瘤、肺癌、脑肿瘤等也有关，这些肿瘤中均可发现雌激素受体(estrogenreceptor，ER)的表达，ER阳性率高的患者愈后差 01。我们既往对63例d,JL常见恶性实体瘤的石蜡切片行ER检测发现：60％的睾丸内胚窦瘤、80％的性腺外内胚窦瘤、60％的NB、29％的肾母细胞瘤ER阳性【lu；我们还发现E不仅能够促进血管瘤内皮细胞增殖，而且可显著协助血管内皮生长因子或碱性成纤维细胞生长因子对血管瘤内皮细胞的促增殖作用，而ER阻断剂三苯氧胺可抑制这种促增殖作用【12,131；我们近期的研究证实E可以促进神经母细胞瘤SK-N—SH细胞株【3'4】、肾母细胞瘤SK-NEP．1细胞株【14J的增殖，E还可增力[ISK．N．SH细胞株的侵袭性和转移性【5】5。这些充分说明E与d,JL恶性肿瘤有关。环境污染一直是个世界性难题。EE是一种重要的环境污染物，主要来源于塑料、杀虫剂、洗涤剂等工业产物，这类物质具有范围广、难以被代谢分解的特点。EE进入机体后可干扰机体的内分泌系统、免疫系统、神经系统等，不仅会严重干扰机体的生殖遗传功能，而且还有致畸、致癌、致突变的作用【15‘20】。随着全球经济和社会的开展，这类物质对环境的污染日趋严重，其对环境和生物的危害也越来越受到科学界和公众的广泛关注。EE与肿瘤的发生、开展之间有确定的关系，有关EE的肿瘤病因学也是当前研究的热点。孕期接触双酚A(BisphenolA，BPA)、有机氯杀虫剂、己烯雌酚等污染物后，子代可发生白血病，并可使子代的乳腺癌、精原细胞瘤发病率增耐21-231；BPA等可促进人乳腺癌细胞株、宫颈癌细胞株和前列腺癌细胞株的增殖【24。261。胎儿及小儿均处于快速的生长发育期，更易受EE的影响，d,JL所患肿瘤多来源于胚胎残留组织与中胚层，其病因多与遗7神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究博士论文·前言传缺陷、激素干扰以及不良环境因素刺激有关，故EE与d'JL恶性肿瘤发生、发展之间也有一定的关系。BPA是最常见的EE，广泛存在于塑料玩具和饮用瓶等生活用品中，儿童的暴露程度更加严重。我们研究证实BP：A能够促进神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株的体内外增殖，这种促增殖作用可被ER拮抗剂阻断，说明BPA是通过ER依赖途径促进SK-N．SH细胞增殖的f3,4j；进一步的研究证实BPA通过上调间质金属蛋白酶2和9的表达、下调金属蛋白酶组织抑制剂2的表达而促进SK-N．SH细胞的侵袭和转移，这种作用也能被ER阻断剂阻断DJ。在我们既往“E和BPA促进神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株的增殖、侵袭和转移’’的研究成果，即E和BPA可促进NB开展的根底上，我们试图探寻E和BPA对NB起始环节的作用，而近年提出的肿瘤干细胞(cancerstemcell，CSC)H口是肿瘤的起源细胞，故我们决定研究“E和BPA对神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株的CSC的影响〞做为我们探寻“E和BPA对NB起始环节有无作用"的突破口。近年通过比照正常干细胞的研究成果，发现肿瘤细胞的特性与干细胞类似，都具有无限增殖和分化的潜能，二者的调节机理也有相似之处，如凋亡的抑制、端粒酶的活化等，故提出Tcsc学说f27，281。该学说认为：肿瘤细胞具有异质性，同一瘤体中只有极少量细胞具有无限增殖的潜能，而其余的绝大多数细胞，经过短暂的分化最终即死亡，这局部细胞和正常干细胞的特性类似，是肿瘤发生、发展和复发的根本原因。虽然CSC学说仍存在着争议129-311，但不同实验室的研究者已在急性髓细胞白血病、乳腺癌、肝癌、恶性神经胶质瘤等众多肿瘤中发现CSC的存在132]，故认为存在CSC是目前的主流趋势。CSC理论的提出是肿瘤研究领域的重大突破，改变了以往“所有瘤细胞均能成瘤、具有转移性、能导致复发"的认识，更重要的是引起肿瘤治疗从“杀死所有瘤细胞"向“铲除这些具有干细胞特性瘤细胞’’的转变。CSC学说同样也为NB的研究指出了一条崭新的方向，早期研究即证实NB细胞异质性明显【33】，后续的进一步研究也发现NB的瘤株和实体瘤中存在CSCl34'351。CSC理论的提出，开创了肿瘤研究的全新方向，对致肿瘤发生、开展、复发起根本作用的CSC的研究，为彻底治愈肿瘤的希望所在，故对CSC的研究是目前肿瘤研究的热点。CSC的研究按深入程度可分为以下三个水平：首先分离出CSC并鉴定所别离的细胞是CSC，其次是对CSC的特性进行研究，最终开展针对CSC的治疗方案以期治愈肿瘤。目前的研究多数仍集中在对各种肿瘤的CSC的别离和鉴定上，CSC特性的研究也有一定的收获，而针对CSC治疗的研究尚未获得明显进展。NB肿瘤干细胞的研究在这三个水平也都开展了，尤其对其CSC的别离有特殊性。其它肿瘤别离CSC的方法主要有l无血清干细胞培养基成球法【36,371、SP细胞分析法网和干细胞标志物法【391，NB因细胞异神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·前言质性明显，通过机械别离的方法即可别离出各异质性细胞，其中别离并建系的I型细胞经鉴定具有干细胞特性，因而提出“I型细胞是NB的干细胞〞的理论[34,40]无血清干细胞球法别离干细胞是一种常用的干细胞研究方法【36，37J，因血清可促进干细胞分化，用不含血清但加用EGF、bFGF、B27等生长因子的DMEM／F12培养基(干细胞培养基)可使神经干细胞成球形生长从而提纯神经干细胞。这种方法应用于神经系统肿瘤中如胶质瘤也可成功别离出CSC，NB也有瘤株能在干细胞培养基中成球形生长。SP分析法是Goodell等【4l】于1996年研究造血干细胞在体内的增殖情况时创造的，他们发现用荧光染料HoechSt33342(Hoechst)染色的小鼠骨髓细胞在双波长的流式细胞仪上能检测到一小群激发为弱蓝光和弱红光的细胞。由于这一小群细胞与其他的骨髓细胞能很好地分开，所以称之为SP细胞(sidepopulation，sP)，中文翻译为侧群或边缘细胞。对其进行别离和鉴定后发现：SP细胞的细胞外表标记(Sca．1p05／L甜。∥10w)和造血干细胞的外表标记相同，且其造血干细胞活性富集了1000--一3000倍，说明它们具有造血干细胞的特性。此后在众多的正常和肿瘤组织中也检测并分选出SP细胞，经鉴定证实它们也具有相应起源组织干细胞的特性【42441，因此SP分析法被接受为一种研究正常和肿瘤干细胞的经典方法，该方法还有在“干细胞标志物不明的情况下’’别离出干细胞的优点[45】，因此其应用范围较其它CSC研究方法更普遍。NB干细胞研究主要集中于机械别离法得到的I型细胞的干细胞特性的研究，近年才见应用干细胞球法、干细胞标志物法和SP法研究NB干细胞的少量文献报道【1,46,471。我们课题组连续性研究所用的SK-N．SH细胞株按I型干细胞理论属混合性细胞株，故我们决定采用其它肿瘤的CSC研究常用的方法别离其CSC，我们首先尝试用操作较为简便的“无血清干细胞球法"于SK-N．SH细胞株中别离出CSC用于研究，但发现这种方法不能于SK-N．SH细胞株中别离出CSC，故改用SP法于SK-N．SH细胞株中别离CSC。因即往应用SP法研究NB干细胞的文献7’48】对所分选SP细胞的干细胞特性鉴定都不太全面，故我们对SK-N．SH细胞株中分选出的SP细胞的干细胞特性进行了系统鉴定，最后对这种具有干细胞特性的SP细胞予以E和BPA干预以明确“E和BPA对NB的起始环节有无作用"。9神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部第一局部SK-N．SH细胞株侧群细胞的检测及其检测条件的优化摘要背景： 对任一新细胞株行SP细胞检测时均应对各检测条件进行摸索，找出适用于此细胞株的最正确检测条件。在探寻适用于SK-N．SH细胞株的最正确SP细胞检测条件的过程中发现SP细胞研究时最常用的Hoechst浓度，即5}l咖l对此细胞株有明显的毒性，因此对此细胞株的Hoechst毒性强烈敏感的机理也进行了探讨。——流式细胞仪检测SP细胞的比例，～～目的：鉴定人神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株中是否存在SP细胞，寻找最正确的检测方法。方法：1．SK-N．SH细胞悬液中参加Hoechst，然后分成二组，其中一组再参加维拉帕米，2．不同的Hoechst孵育时间，不同的维拉帕米浓度，观察SP细胞检测效果。3．不同浓度的Hoechst染色后的表型观察、CCK-8活细胞数评定，同时以人肝癌HCCLM3细胞株和人喉癌Hep-2细胞株做对照，了解Hoechst对SK-N．SH细胞株的毒性。4．不同浓度Hoechst染色后的流式细胞仪细胞周期分析、AnnexinV．FITC和碘化丙啶(propiduimiodide，PI)双标法的流式细胞仪凋亡及死亡分析、再培养后SP细胞比例的检测，探讨HoecMt对SK-N．SH细胞株毒性的机理。5．比照不同浓度Hoechst对SK-N-SH细胞株的SP细胞检测效果，选择出最正确Hoechst浓度。结果：1．SK-N．SH细胞株中存在SP细胞，SP细胞比例为3．6-t-0．2％。2．Hoechst的孵育时间选为60min，维拉帕米的浓度选为50pmol／L。3．表型观察及CCK-8分析证实3．75和5肛酌[11l的Hoechst染色60min后可显著抑制SK-N．SH细胞的生长，而5“酌!Ill的Hoechst对Hep·2细胞无明显毒性、：0肛g／ml的Hoechst对HCCLM3细胞无明显毒性。4．流式细胞周期分析示3．75和5pg／rra的Hoechst染色60min后能显著阻滞细胞周期于S期：AnnexinV．FITC和PI双标法的流式细胞分析示随Hoechst浓度增加细胞死亡和凋亡增多；通过检测不同浓度Hoechst染色后正常生长培养基再培养72d,时后各组的sP细胞比例，证实sP细胞和NSP细胞同样对Hoechst毒性反应敏感。神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部5．通过比照不同浓度Hoechst的SP细胞检测效果和毒性，选择51．tM(2．8rtg／m1)浓度用于SK-N．SH细胞株的SP细胞检测。结论：SK．N．SH细胞株的SP细胞比例为3．6±0．2％。SP细胞研究时要警惕Hoechst的毒性。任一将行SP细胞研究的新细胞株，对SP细胞检测的系列条件均应予优化以寻及最正确检测条件。引言1996年，Ooodell等【4l】在用Hoechst染色法研究小鼠骨髓细胞时，发现极少数细胞可以将进入细胞的Hoechst染料排出细胞外，在荧光显微镜下观察或流式细胞检测时表现为不着色，在紫外光激发的流式散点图上，这群细胞呈“尾状"位于主体细胞群的一侧，所以他们将这群细胞命名为sidepopulmion细胞，简称sP细胞，中文翻译为侧群细胞或边缘细胞。Goodell等进一步研究发现此群细胞富积造血干细胞，自此以后，人们在其它正常组织中也检测出SP细胞，并研究证实不同组织来源的SP细胞具有其相应组织的干细胞特性【49．511。借鉴于正常组织的SP细胞研究，后来人们在众多肿瘤组织的细胞株及实体瘤中也检测出SP细胞，迸一步的研究发现各肿瘤组织中检测出的SP细胞也具有干细胞特性【5玉〞】。正常及肿瘤组织中SP细胞研究的结果均证实SP细胞具有干细胞特性，因此SP细胞分析法被接受为一种经典的干细胞研究方法【381。SP法检测及分选具有干细胞特性的细胞(即SP 56l如下：Hoeehst是一种能与DNA的A．T富积区相结合的活细胞染料；干细胞拥有Hoechst外排泵，这个泵主要就是ABCG2膜蛋白，而非干细胞无外排Hoechst的ABCG2膜蛋白，故具有干细胞特性的细胞不被Hoechst染色，而非干细胞均被Hoechst染色；维拉帕米是ABCG2泵的特异抑制剂，经维拉帕米抑制ABCG2泵后的干细胞不再具有外排Hoechst的功能，因此也能被Hoechst染色；用Hoechst染色活细胞时，另外设同时加Hoechst和维拉帕米的对照，在紫外激发的流式细胞仪上，Hoechst着色的细胞同时发蓝光和红光，Hoechst染色阴性的SP细胞位于流式散点图的蓝光和红光均弱的左下区域(呈尾状)，同时加Hoechst和维拉帕米组因Hoechst阴性细胞消失，故流式散点图上相应于未加维拉帕米组的区域即消失，以此消失的区域为“门〞，再比照未加维拉帕米组流式图形的相应区域，此区域即为SP细胞富积区域，流式软件可计算出此区域细胞占细胞总数的百分比，即各细胞株的SP细胞比例，流式细胞仪在剔除细胞碎片和碘化丙啶(PI)着色的死细胞后可分选出活的SP和非SP细胞(non．SP，NSP)，因所有操作过程都是在无菌状态下完成的，故分选后的细胞可继续培养并进行系列神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部5．通过比照不同浓度Hoechst的SP细胞检测效果和毒性，选择51．tM(2．8rtg／m1)浓度用于SK-N．SH细胞株的SP细胞检测。结论：SK．N．SH细胞株的SP细胞比例为3．6±0．2％。SP细胞研究时要警惕Hoechst的毒性。任一将行SP细胞研究的新细胞株，对SP细胞检测的系列条件均应予优化以寻及最正确检测条件。引言1996年，Ooodell等【4l】在用Hoechst染色法研究小鼠骨髓细胞时，发现极少数细胞可以将进入细胞的Hoechst染料排出细胞外，在荧光显微镜下观察或流式细胞检测时表现为不着色，在紫外光激发的流式散点图上，这群细胞呈“尾状"位于主体细胞群的一侧，所以他们将这群细胞命名为sidepopulmion细胞，简称sP细胞，中文翻译为侧群细胞或边缘细胞。Goodell等进一步研究发现此群细胞富积造血干细胞，自此以后，人们在其它正常组织中也检测出SP细胞，并研究证实不同组织来源的SP细胞具有其相应组织的干细胞特性【49．511。借鉴于正常组织的SP细胞研究，后来人们在众多肿瘤组织的细胞株及实体瘤中也检测出SP细胞，迸一步的研究发现各肿瘤组织中检测出的SP细胞也具有干细胞特性【5玉〞】。正常及肿瘤组织中SP细胞研究的结果均证实SP细胞具有干细胞特性，因此SP细胞分析法被接受为一种经典的干细胞研究方法【381。SP法检测及分选具有干细胞特性的细胞(即SP 56l如下：Hoeehst是一种能与DNA的A．T富积区相结合的活细胞染料；干细胞拥有Hoechst外排泵，这个泵主要就是ABCG2膜蛋白，而非干细胞无外排Hoechst的ABCG2膜蛋白，故具有干细胞特性的细胞不被Hoechst染色，而非干细胞均被Hoechst染色；维拉帕米是ABCG2泵的特异抑制剂，经维拉帕米抑制ABCG2泵后的干细胞不再具有外排Hoechst的功能，因此也能被Hoechst染色；用Hoechst染色活细胞时，另外设同时加Hoechst和维拉帕米的对照，在紫外激发的流式细胞仪上，Hoechst着色的细胞同时发蓝光和红光，Hoechst染色阴性的SP细胞位于流式散点图的蓝光和红光均弱的左下区域(呈尾状)，同时加Hoechst和维拉帕米组因Hoechst阴性细胞消失，故流式散点图上相应于未加维拉帕米组的区域即消失，以此消失的区域为“门〞，再比照未加维拉帕米组流式图形的相应区域，此区域即为SP细胞富积区域，流式软件可计算出此区域细胞占细胞总数的百分比，即各细胞株的SP细胞比例，流式细胞仪在剔除细胞碎片和碘化丙啶(PI)着色的死细胞后可分选出活的SP和非SP细胞(non．SP，NSP)，因所有操作过程都是在无菌状态下完成的，故分选后的细胞可继续培养并进行系列神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部研究。．从上述原理可以看出SP法检测SP细胞的主要步骤如下：选择状态良好的细胞制成悬液，参加Hoechst染色，同时设另外一组同时参加Hoechst和维拉帕米，染色结束后再参加PI，上流式细胞仪进行SP细胞的检测和分选。此步骤看似简单，但涉及的条件众多，如Hocchst的浓度、Hoeehst孵育时间、维拉帕米的浓度等等，对任何～将行SP细胞研究的新细胞株，各检测条件均要进行摸索以寻及适用于此细胞株的最正确检测条件。SP法的最关键之处是要用Hoechst染料检测和分选SP细胞，因分选出的细胞要再培养以进行研究，这就要求用于研究的Hoechst对活细胞是无毒的。做为能与活细胞DNA相结合的核染料，它是确定有毒的，只是一般认为低浓度的Hoechst是相对无毒的，可以用于活细胞的系列研究。文献报道应用于SP细胞研究的Hoechst浓度范围在2．5"-．-20肛g／rnlt43,57,58J。我们在对SK-N．SH细胞株进行SP细胞检测时，首先进行各检测条件的优～化，同时我们发现此细胞株对Hoeehst毒性特别敏感，对其它肿瘤无明显毒性的低浓度Hoechst对此细胞株有明显的毒性，因此我们在优化用于此细胞株SP细胞检测的各条件时也做了一系列实验试图探寻此细胞株对Hocchst毒性敏感的机理，最后找出了能有效于此细胞株检测SP细胞并相对无毒的Hoechst浓度。材料与方法一．材料(一)主要实验仪器设备超净工作台 BJ一1CDBoxun 中国二氧化碳培养箱Hemeusinstruments 中国低速离心机 AB_keTDL-40B 中国低温高速离心机 Beckman 德国各种微量加样器 Gilson 法国电热恒温水槽DK-8D 中国倒置光学显微镜 Olympu 日本流式细胞仪 Bio一＆狮 美国BDFACSCalibur流式细胞仪 Bio．mm 美国精密天平(BSllOS) Sartofius 德国酶标仪(Bio．RadModel550) Bio—RAD 美国双蒸水机 Bamstead 美国(二)主要材料、试剂12神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部人神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株购自中国科学院细胞库人喉癌Hep．2细胞株复旦大学附属眼耳喉鼻医院万光伦博士惠赠人肝癌HCCLM3细胞株复旦大学附属中山医院肝癌研究所施国明博士惠赠RPMI1640培养液Gibco英国DMEM培养液 Sigma-Aldrich 美国胎牛血清 Biochrom 德国各型细胞培养瓶、离心 Coming 美国管、细胞培养板CellCountingKit·8 同仁化学研究所 日本Hoechst33342 Sigma-Aldrich 美国碘化丙啶(PI) Sigma-Aldrich 美国维拉帕米 Sigma-Aldrich 美国NaCl 北京化学试剂公司 中国Na2HP04 北京化学试剂公司 中国K2HP04 北京化学试剂公司 中国KCl 北京化学试剂公司 中国青霉素 石家庄华北制药股份有限公司 中国链霉素 石家庄华北制药股份有限公司 中国无水乙醇 上海科兴生物科技有限公司 中国胰蛋白酶(0．25％Trypsin GibcoBRI，Ine 美国／0．02％EDTA)O．25％胰蛋白酶 上海钰森公司 中国核糖核酸酶A(RNaseA) Sigma-Aldrich 美国0．2Itm过滤器 Millipore 美国D．Hank’s液 上海钰森公司 中国(三)溶液配制1． 青霉素储存液：80万单位的干粉充分溶解于4ml去离子水中，．20。C保存，配1升培养基时加O．5毫升。2．链霉素储存液：100万单位的干粉充分溶解5ml去离子水中，．20"C保存，配1升培养基时DNo．5毫升。3．RPMI1640和DMEM培养液的配制：1袋粉剂培养基按说明参加NaHC03，再参加青霉素、链霉素，定容至1000ml，1MNaOH或HCl滴定PH值至7．2，无菌滤器加压过滤、分装备用。4．1×PBS：NaCl89，KClO．29，Na2HP04H201．569，KH2P040．29，溶解于双蒸神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部水中，定容至1000ml。5．Hoechst33342：10mg溶于20ml三蒸水中，成500rtedInl，0．2mn滤器过滤、分装，4"C避光保存。实验时按照终体积每“细胞悬液中参加409l、30：、20：、10m、7．5Ill、5}ll、2．5“1的原液分别成20pg／ml、15肛g／ml、10pg／rrd、5pg／rrd、3．75J．tg／rra、2．599／ml、1．25pg／rrd的终浓度。5州Hoechst配制：2．81mg溶于10ml=蒸水中，成500rtM，0．2pan滤器过滤、分装，4"C避光保存，实验时按照终体积每砌细胞悬液中参加10“l成5州的终浓度。6．碘化丙啶：10mg溶于10mlPBS中，成lmg／ml，0．21xrn滤器过滤；取lmg／ml的PI溶液lml力19mlPBS，成100}tg／ml，分装，4℃避光保存，实验时按照终体积每ml细胞悬液qb力l；l,h．101xl的原液。7．维拉帕米：10mgVerapamil溶于4mlPBS中，浓度为5mmol／L。实验时按照终体积每叫细胞悬液中力nXlO：成501amol／L。8．RNaseA溶液：将RNaseA溶解在0．001mol／L醋酸钠(PH5．2)中，使终浓度为一——10mg／ml,加热到100"(2t5min,室温下缓慢冷却，用IM的Tris．CI调整pH至7．4后，分装后．20℃保存。9．含RNaseA的碘化丙啶溶液：5mg碘化丙啶溶于lml浓度为10mg／ml的RNaseA溶液中，过滤、分装，实验时按照终体积每“细胞悬液中力neklOrtl成50鹇／IIllPI和100rtg／mlRNaseA的终浓度二．人神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株、人喉癌Hep-2细胞株和人肝癌HCCLM3细胞株的准备(一)细胞的培养SK-N-SH、Hep-2细胞在含10％胎牛血清、100U／mL青霉素、100J_tg／m]链霉素的RPMI1640培养液中培养，HCCLM3细胞在含10％胎牛血清、100U／ml青霉素、10099／ml链霉素的DMEM培养液中培养，培养条件均为37"C，5％C02，饱和湿度。细胞培养过程中，定期在倒置相差显微镜下观察，注意培养液有无浑浊、污染，细胞有无死亡等现象。(二)细胞的换液与传代：待培养液颜色变黄后，用吸管将原培养液吸掉，然后参加新鲜培养液，放入37"C，5％C02，饱和湿度条件下继续培养。当细胞长满约瓶底的80％时传代，先吸去原培养液，用D．Hank’S液洗2次，然后参加0．25％胰蛋白酶／0．02％EDTA消化液，放在显微镜下观察，当细胞明显收缩时，参加含有血清的相应培养液中止消化，吸管吹打成单细胞悬液，l-2或3传代。(三)细胞的冻存与复苏1．细胞的冻存14神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部[1】1准备冻存液：培养液：血清：DMSO=7：2：1配制冻存液，充分混匀，4℃冷却备用。【2】细胞消化：将对数生长期的细胞用D．Hank’s液洗2次后参加0．25％胰蛋白酶／0．02％EDTA消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液全部覆盖细胞外表。将培养瓶置于培养箱中，SK-N．SH、Hep．2、HCCLM3细胞分别消化约1、10、3min或在倒置显微镜下观察确认细胞已经变圆。[3】参加培养液约3毫升终止消化，用吸管吹打混匀，制成单细胞悬液，吸入离心管中。 [4】调整浓度；计数并调整细胞浓度为2～5×106／ml。[5】离心，1000rpm，5min，弃上清。[6]6逐滴参加冻存液，轻轻吹打混匀成单细胞悬液，参加冻存管中，每管1．8毫升。【7】逐步降温冻存：将冻存管用医用脱脂棉包裹后4"C半小时、．20℃2小时、．80℃过夜逐步降温，最后取出迅速放入液氮中。2．细胞的复苏：[1】快速升温融化细胞：将细胞从液氮罐中取出，迅速置于37"C水浴箱中，令其在lmin内彻底融化。[2】洗涤细胞：吸出细胞悬液，移入离心管中，参加37"C预温的培养液，用滴管轻轻吹吸5---．6次洗涤细胞。【3】离心培养：1000rpm离，L,5min，吸弃上清液。用5ml培养液重新悬浮细胞，移入25cm2培养瓶中，放入培养箱中，37℃、5％C02、饱和湿度培养。【4】结果观察：4小时后观察，见大局部细胞已经贴壁，只有少量飘浮细胞。[5】长满后传代：一般过夜后细胞即长满培养瓶底，长满后即予传代。三．Hoechst孵育时间确实定1．实验分组：按Hoechst孵育时间分为45、60、90min3组。2．Hoeehst染色：取对数生长期状态较好的细胞，0．25％胰蛋白酶／0．02％EDTA消化后离心，再用含2％FBS的PBS重悬，制备成浓度为l×106／ml的单细胞悬液，分成3组，均力1])kHoechst成51ag／ml的终浓度，每组再分成2组，其中一组再参加维拉帕米成501amol／Ll拘终浓度，370C分别孵育45、60、90rain，每隔15min混匀一次，孵育时间点到后立即冰上放置以终止染色。3．离心后PBS洗1遍，含2％FBS的冷PBS重悬细胞，JJIAPI成l}tg／ml的终浓度，冰上放置。4．流式细胞仪(BDFACSCalibur)检澳I]Sp细胞比例。Hoechst激发光波长为350nnl，405／30带通收集蓝光，570／20带通收集红光。PI用488nm蓝光激发，630／30带通收集红光。神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部四．维拉帕米浓度确实定1．实验分组：按维拉帕米浓度分为50、100、1501amol／L3组。2．Hoeehst染色：取对数生长期状态较好的细胞，0．25％胰蛋白酶／0．02％EDTA消化后离心，再用含2％FBS的PBS重悬，制备成浓度为1×106／ml的单细胞悬液，分成3组，均力lLKHoechst成5I-tg／ml的终浓度，每组再分成2组，其中一组分别参加维拉帕米成50、100、150rtmol／Ll拘终浓度，370C均孵育60min，每隔15min混匀一次，孵育时间点到后立即冰上放置以终止染色。3．离心后PBS洗1遍，含2％FBS的冷PBS重悬细胞，参加PI成lpg／ml的终浓度，冰上放置。4．流式细胞仪(BDFACSCalibur)检测SP细胞比例。五．Hoechst染色后的表型观察1．实验分组：按Hoechst的染色浓度将SK-N．SH、Hep-2、HCCLM3每个细胞株均分为5组：SK-N．SH和Hep．2细胞均以Hocchst终浓度为0，1．25，2．5，3．75和5——rtg／眦分为5组，HCCLM3细胞以Hoechst．．终浓度为0，5，10，15，20p咖1分为5组。2．Hoechst染色：取对数生长期状态较好的细胞，O．25％胰蛋白酶／0．02％EDTA消化后离心，再用含2％FBS的PBS重悬，制备成浓度为1×106／irll的单细胞悬液，各细胞均分成5组，分别参加Hoechst成上述终浓度，SK-N．SH细胞370C染色60min，H印—2和HCCLM3细胞参照文献【43，59】370c染色90min，均每隔15min混匀一次。3．细胞再培养：染色结束后立即冰上放置终止染色，离心、PBS洗涤1遍，各细胞株的各组均取2×105个细胞以各细胞株的相应正常生长培养基培养于3．5cm培养皿中。4． 细胞形态的观察：培养724'时后在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。实验重复3次。六．Hoechst染色后的CCK-8活细胞计数评估1．实验分组：同上。2．Hoechst染色：同上。3．细胞再培养：染色结束后，离心、PBS洗涤1遍，各细胞株的各组均以相应正常生长培养基培养于96孔板中，每孔接种l×104个细胞，每个实验组设5个重复孔，整个实验重复3次。4．CCK-8检测：细胞接种后的24、48和724,时分别行CCK．8检测。步骤如下：每孔JJHAlopI的CCK-8溶液，37"C孵育24,时，酶标仪在450nm澳d定吸光度，以吸光度数值(absorbancevalue，AV)关联活细胞数。16神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部七．Hoechst染色后的Annexin．V／PI双标法检测细胞凋亡和死亡1．用双蒸水稀释4XAnnexinV．FITC结合液至1×。2．用0．25％胰酶(不含EDTA)消化SK-N．SH细胞，轻吹打后200目滤器过滤，离心后用含2％FBS的PBS重悬细胞至浓度为1×106／ml，分成5组，每组取lml细胞悬液，各组参加Hoechst使终浓度为0，1．25，2．5，3．75和51．tg／ml，37。C染色60min，1000rpm离心。3．PBS洗涤细胞2次，1000rpm离，L,5min，弃上清，用PBS重悬。4．取104(100p1)重悬的细胞，1000rpm离。t二,5min，弃上清，JJl：l／X1951．tlAnnexinV．FITC结合液(1×)轻轻重悬细胞。5．参加5p．1AnnexinV．FITC，轻轻混匀。室温(20～25"C)避光孵育10min。6．1000rpm离。1)5min，弃上清，参加190“1AnnexinV-FITC结合液(1×)轻轻重悬细胞。7．参加10I．tl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。8．流式细胞仪检测。9．凋亡和死亡细胞的判断：AnnexinV．FITC阴性而PI阳性的细胞定为实验过程中的机械损伤所致；AnnexinV．FITC和PI均阴性的细胞定为正常细胞；AnnexinV．FITC和PI均阳性的细胞定为死亡细胞；AnnexinV．FITCIjH性而PI阴性的细胞定为凋亡细胞。10．实验重复3次。八．Hoechst染色后的细胞周期分析1．实验分组：同上。2．Hoechst染色：同上。3．细胞再培养：染色结束后，离心、PBS洗涤1遍，SK-N．SH细胞株的各组均以正常生长培养基培养于25cm2培养瓶中。4．培养72dx时后，0．25％胰酶／0．02％EDTA消化细胞，计数后取1×106细胞，离心。5．PBS清洗细胞1次，离心后弃上清。6．加100“lPBS将细胞沉淀轻轻吹打均匀后，用移液器吸取并快速注入到1．9ml74％冷乙醇(乙醇终浓度为70％)中，4℃固定过夜。7．离心去除乙醇。8．PBS清洗细胞1次，离心后弃上清。9．参加含0．1mg／mlRNA酶、50肛g／mlPI的PBS液lml，37"C、5a％C02孵箱内孵育30min。lO．冰上放置，流式细胞仪分析。17神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部11．软件(CELLQuestversion5．1，BectonDickinsonBioscience)分析G0／G1，S和G2／M期细胞的比例。12．实验重复3次。九．Hoechst染色并再培养后的流式细胞仪SP细胞的检测1．Hoeehst染色：取对数生长期状态较好的SK-N．SH细胞，0．25％胰酶／0．02％EDTA消化后离心，再用含2％FBS的PBS重悬，制备成浓度为1X106／ml的单细胞悬液，然后分成5组，分别参加Hoecchst成0、1．25、2．5、3．75和5p咖l的终浓度，370C染色60mha，均每隔15min混匀一次。2．细胞再培养：染色结束后，离心、PBS洗涤1遍，各组均在25cm2培养瓶中以正常生长培养基724'时。3．各组均0．25％胰酶／0．02％EDTA消化后离心，再用含2％FBS的PBS重悬，制备成浓度为1×106]nil的单细胞悬液，力[1,KHoecchst成5p咖l的终浓度，各组均再分2组，其中1组参加维拉帕米成501amol／L的终浓度，37。C染色60min，均每隔15min混匀一次一4．染色结束后离心、PBS洗一遍。5．含2％FBS的冷PBS重悬细胞，参加PI成1pg／ml的PI终浓度，冰上放置。6．流式细胞仪(BDFACSCalibur)分析。7．实验重复3次。十．最正确Hoechst浓度确实定1．Hoechst染色：取对数生长期状态较好的SK-N．SH细胞，0．25％胰酶／0．02％EDTA消化后离心，再用含2％FBS的PBS重悬，制备成浓度为1×106／ml的单细胞悬液，然后分成4组，分别参加Hoecchst成1．25、2．5、3．75和5I-tg／ml的终浓度，各组均再分2组，其中1组参加维拉帕米成501maol／L的终浓度，370C染色60min，均每隔15min混匀一次。2．染色结束后离心、PBS洗一遍。3．含2％FBS的冷PBS重悬细胞，参加PI成lrtg／ml的终浓度，冰上放置。4． 同前流式细胞仪分析SP细胞比例。5．实验重复3次。十一．统计学处理数据用SPSS13．0(SPSS，Ine，Chicago，111)处理，结果以均数±标准误(mean_SEM)表示，趟验及成组设计的方差分析进行组间比拟，P<0．05为有统计学差异。18神经母细胞瘤侧群细胞的f二细胞特性搭定及雌激索和舣酚A对其作_【}』的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的f二细胞特性搭定及雌激索和舣酚A对其作_【}』的研究 博士论文·第‘局部结果一．60min的Hoechst孵育时f’自J、509mol／L的维拉帕米可有效检出SH．N—SH细胞株中的SP细胞以599／ml的Hoechst、50I．tmol／L维拉帕米为标准确定Hoechst的孵育时间以60min为宜。45min孵育时间的流式图形不出现典型的“尾状〞SP细胞，60弄H90min孵育时『白J的流式图形均出现典型的“尾状〞SP细胞，应选定60min为孵育时间。599／ml的Hoechst、60min的HoechstO呼育时间为标准确定维拉帕米的浓度以509mol／L为宜。509mol／L的浓度即可有效使流式图形的SP区域消失，而此浓度为SP细胞研究时最常采用的浓度，应选定509mol／L的维拉帕米浓度。二．SK．N—SH细胞株对Hoechst毒性反响敏感不同浓度的Hoechst染色SK-N—SH、Hep一2和HCCLM3细胞后再用各自的J下常生长培养基培养72d'时，结果见：对SK—N—SH细胞，0、1．25禾n2．599／mlHoechst染色的各组细胞形态无明显不同，但3．75矛H599／ml的Hoechst染色组可见多数细胞死亡，表现为细胞脱离培养瓶底，另外可见599／n[1lHoechst染色组死细胞数目明显较3．751ag／ml组多(图1)；Hep2和HCCLM3细胞各浓度Hoechst染色组均未见明显的细胞形态不同(图2、3)。说明SK-N．SH细胞对Hoechst毒性反响敏感，常用于SP细胞研究的低浓度Hoechst对其也有毒性。图1 SK．N．SH细胞各浓度Hoechst染色后再正常培养基培养72d,H,-J的细胞形态蚓。图A、B、C、D和E分别对应的Hoechst浓度为0、1．25、2．5、3．75年11599／ml(200×)神经母细胞痛f!j!|j群细胞的1。细胞特性搭定及雌激素和双酚A对其作用的研究神经母细胞痛f!j!|j群细胞的1。细胞特性搭定及雌激素和双酚A对其作用的研究博．卜论文·第‘局部}攀挚麓1l／[[-_-k≯。≥拳豢』，|图2Hep2细胞各浓度Hoechst染色后再正常培养基培养72小时的细胞形态图。图A、B、C、D和E分别对应的Hoechst浓度为0、】．25、2．5、3．75和5肛∥zlll(200×)图3HCCLM3细胞各浓度Hoechst染色后再正常培养基培养726'时的细胞形态图。图A、B、C、D币IlE分别对戍的Hoechst的浓度为0、5、10、15和20lag／m](200X)为进一步证实这些低浓度Hoechst对SH．N．SH细胞株的毒性效果，我们用CCK-8分析法定量检测了不同浓度Hoechst染色后再培养的各细胞株在不同时间点各浓度组的活细胞数目。对SK—N．SH细胞株，Hoechst染色后再正常培养基培养24d'时，3．75矛HSlag／mlHoechst染色组的活细胞数目均显著降低，0、3．75、599／mlHoechst染色组各自的平均AV值分别为0．1942±0．0195、0．1704±0．0076、0．1476±O．0120p<0．05，3．7599／ml组VS099／ml组；P<0．0l，599／ml组VS0pg／ml组)，这种活细胞数日降低的趋势同样见于再培养48和72小时时I’白J点，而0、1．25、2．5gg／mlHoechst染色组存24、4S；F／／72小时各时问点均无明显差异(表l、图4)。Hep一2和20神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部HCCLM3细胞株的各浓度Hoechst染色组在24、48牙1172d,时各时问点活细胞数目均无明显差异(IN5、6)。表1SK-N．SH细胞各浓度Hoechst染色后正常培养基再培养后的相应时间点CCK一8检测(7。+_SEM，n=3)注：与0gg／ml组比拟聿尸<0．05，p<0．01l_——-H3420ug／mlj[二]H3421．25ug／m!矗蜘H3422．5ug／ml∞筋加佰伯帖O．00一Ecom寸一价①：一嵋>oDc啜cI-lo∞cl? 24h 4Bh 72hTime(hours)图4 SK-N．SH细胞各浓度Hoechst染色后正常培养基再培养后的相应时间点CCK一8检测(4尸<O．05，4P<0．01)站∞站船幅∞帖∞一uJcob寸一西m：一再>口uc碍cl-Io圻cI? 一—IJco∞寸一竹03一峭>muc侣D．Io协D? Times?hours) Times(hours)图5Hep．2细胞各浓度Hoechst染色后正常培养图6HCCLM3细胞各浓度Hoechst染色后正基再培养基后的相应时间点CCK一8检测 培养基再培养后的相应时间点CCK．8检测2l神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·第一局部三．Hoechst能致SK-N．SH细胞死亡和凋亡不同浓度的Hoechst染色SK-N．SH细胞60min后立即行AnnexinV-FITc／PI双标法流式分析凋亡和死亡细胞比例，计算重复三次实验的平均百分比，0p酌：nlHoechst染色后的细胞死亡百分比是17．5％、凋亡细胞百分比是3．9％，而1．25、2．5、3．75和599／mlHoechst染色后的的死亡细胞百分比分别是20．0、20．1、25．4和29．2％，凋亡细胞百分比分别是4．3、5．3、8．7和10．9％，可见明显的随Hoechst浓度增高而增多的细胞死亡和凋亡(图7)，说明Hoechst可导致SK-N—SH细胞的死亡和凋亡。表2SK-N．SH细胞各浓度Hoechst染色后细胞的死亡和凋亡检测(4-SEM，n-3)注：与0gg／ml组比拟叩<o。01表3SK-N-SH细胞各浓度Hoechst染色后正常培养基培养72h的细胞周期分析(4-SEM，n=3)注：与0ltg／ml组比拟·JP如．05，。。如．01神经母细胞瘤侧群细胞的f细胞特性峪定及雌激素和舣酚A灯其作州的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的f细胞特性峪定及雌激素和舣酚A灯其作州的研究 博十论文·第+局部宝H342Opg，ml2Z呈 皇 3飞n H3421．25pglml0I譬暑00 一1jo～诗I。’而2_舻谛 ▲l-■■■H3422．5pg／mlH3423．75pglml0∞飞n。-七飞。口一 H34251J口，ml飞n。一飞10I。。一 ∞∞罩}一零一口西一二△m—u?u=mu一零～∞一∞O_AoA■口c辱LI_再o々=oU c—n=ouConcentrationsofHoechst ConcentrationsofHoechst图7SK—N-Stt细胞各浓度Hoechst染色后细胞 图8SK．N，SH细胞各浓度Hoechst染色后的夕匕亡和凋亡检测 正常培养基培养72h的细胞阁j{IJ分析23神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究