微藻培养与光生物反应器

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第七章海洋微藻培养技术与光生物反应器（1）掌握海洋藻类的分类及微藻营养模式（2）熟悉藻种的分离纯化（3）了解海洋微藻培养技术（4）了解光生物反应器及其微藻培养系统第2页/共40页第一部分微藻及其应用

1.微藻定义及分类

藻类是能够进行放氧光合作用的自养无胚植物

藻类按细胞大小

大藻(如海带、紫菜、裙带等)

微藻(如小球藻、螺旋藻、盐藻、栅藻、紫球藻、雨生红球藻、鱼腥藻等)按生长的环境水生微藻陆生微藻

气生微藻

按生活方式浮游微藻底栖微藻淡水生

海水生

第3页/共40页2.微藻的应用价值

微藻具有三个基本特性

种类很多，生理学和生化特性范围很广,因此微藻能产生很多功能独特的脂肪、多糖、蛋白、类胡萝卜素等生物活性物质；微藻能低成本地将用于标记的同位素13C、15N和2H结合进入体内,因而这类标记元素可进入微藻产生的各种代谢产物中；微藻包括了一个大而尚未开发的生物类群，因而提供了一个实质上未开发的资源宝库。

微藻的特性,决定了微藻在医药、食品、水产养殖、化工、能源、环保、农业及航天等领域有着重要的开发价值第4页/共40页微藻的应用价值

医药来源

微藻中的生物活性物质具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、防治心血管疾病、防治老年人痴呆症等功能。

螺旋藻对于糖尿病、高血压、心脏病、胃病、贫血病、肝病、肾脏病、风湿病、骨质疏松症、肥胖症、营养不良、癌症、爱滋病等具有预防和辅助疗效。保健食品微藻中含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸、维生素、多糖、矿物质等,是极好的天然保健食品。

此外，微藻中含有大量的天然色素。

第5页/共40页微藻的应用价值饵料虾和蟹在长成过程中主要使用动物饵料(如轮虫、卤虫等)，而培养这些动物本身所用的饵料全部是微藻。微藻中的不饱和脂肪酸是水产动物不可缺少的营养，一些微藻产生的虾青素等色素对人工养殖的虾和鱼具有很好的着色作用。

基因工程产品

如兔防御素（NP-1）、金属硫蛋白（MT）、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、磷酸酯酶、超氧化物歧化酶（SOD）及杀幼蚊毒素等。利用微藻作为表达系统生产基因工程产物具有两大优点:①无知识产权问题;②产物的分离纯化较简单。其它应用能源航天化工环保农业第6页/共40页3.微藻的国内外应用现状及存在的问题

微藻产业已初见倪端,但尚未真正形成，其原因分析如下：微藻产品的产业化包括五个环节：获得优质藻种(即微藻上游生物技术)微藻的大规模培养微藻的大规模采收(即从培养液中分离出微藻细胞)微藻细胞内产物的分离提取产品开发目前我国在微藻生物上游技术方面具有较好的工作基础(尤其是在微藻基因工程方面处于国际先进水平)，而在微藻的大规模培养、采收和胞内产物的分离提取方面基础薄弱，它是制约我国微藻产业形成的根本原因所在。第7页/共40页第二部分微藻营养模式

微藻原核微藻(蓝藻)真核微藻(其它微藻)主要的营养方式是光自养

也存在着其他的营养模式

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微藻光自养培养

微藻大多数是专性光合自养生物，以光作为能量还原CO2同化为碳水化合物，而获得生物量。光合成反应如下：

CO2+NO3-+PO43-+H2O+太阳能[CH2ONP]+O2

目前国内外微藻的大规模培养均属光自养培养。第9页/共40页微藻光自养生长的影响因子光照溶解氧

培养液pH营养盐温度第10页/共40页光照

光是微藻生长的重要限制因素。当温度和营养不限制其生长时，光就成为影响微藻光自养生长的主要因素。光不仅有光周期、光质和光强的不同，还有明显的时、空（纬度、水体深度〕的变化。第11页/共40页光照

一般情况下，在一定光照度范围内，微藻的光合作用效率会随光照度的增加而增加，但当光照度达到一定值时，光合作用效率几乎保持在一定水平，不再增加，这种现象称为光饱和效应。如果光照度超过光饱和点一定限度后，微藻的光合作用效率将会下降，导致细胞生长减缓，甚至死亡，这就是通常所说的光抑制现象。第12页/共40页溶解氧

微藻光自养培养过程会产生大量氧气，需从培养液中解析出去。对于管道式光生物反应器系统，溶解氧的积聚是一个严重的问题，需要专门设计的脱气系统有效释放光合作用放出的氧气。第13页/共40页培养液pH

微藻光自养培养过程的pH基本呈上升趋势

控制培养液pH的最好方法是利用CO2

第14页/共40页营养盐微藻生长所需要的营养元素有15～20种，C、N、P是微藻生长的主要营养。

对于微藻光自养生长而言，主要利用无机态的碳源。微藻可直接利用空气中的CO2进行生长，但CO2必须先溶解于水中，且主要以HCO3－的形式被利用。

HCO3－盐也可直接作为微藻生长的碳源，如螺旋藻大规模培养常采用的是NaHCO3。第15页/共40页温度

一般在18～25℃，但因藻种的不同其最适温度有所差异，具有不同的温度忍受限，如某些蓝藻可在93℃下正常生活，而另外一些绿藻则可在冰雪中生长。第16页/共40页微藻的异养培养微藻在无光照的条件下，利用外源有机物包括糖类、蛋白水解物、有机酸等进行生长。异养用培养基一般是在光能自养培养基的基础上添加葡萄糖、乙酸盐、甘油等有机碳源，蛋白等有机氮源等。第17页/共40页微藻大规模异养培养的优缺点

与光合自养培养相比较，微藻大规模异养培养具有如下优点:微藻生长繁殖速度加快，藻生物量浓度大大提高。在异养培养时，藻细胞浓度可达到或接近大肠杆菌及酵母的浓度。如美国Market公司异养培养Nitzschiaalba以生产EPA时，64h藻体浓度达45－48g/L(Barclayetal,1994)。Running等人(Runningetal,1994)异养培养Chlorellapyrenoidosa以生产维生素C，藻浓度最高可达100g/L。第18页/共40页从工业化角度分析，异养培养系统更便于生产过程控制以实现纯种培养及稳定的生产。对于食品、高附加值精细化工产品以及一些属于医药授权范围内的产品（包括藻类基因工程产品），其生产必须是封闭式纯种培养。在封闭的生物反应器中进行微藻异养培养，不但可实现纯种培养而且还可保证生产的重复性和连续性。使用异养培养系统可降低微藻生产成本。采收成本占现在微藻生产总成本的比例高达33%。高的微藻浓度可降低采收困难、减少所需处理的藻液体积，从而有效地降低采收成本及微藻生产的总成本。微藻异养培养技术同异养微生物培养技术极为相似，因而可借鉴微生物培养中的成熟技术及设备，来实现微藻大规模异养培养，这将大大加快微藻及其产品的产业化进程。第19页/共40页微藻异养培养在具有上述优点的同时也具有几个缺点

:已知可异养培养的微藻种类较少；易被细菌污染；低浓度水溶性有机物对微藻生长产生抑制作用；不能生产光诱导物（如色素等）可通过广泛的藻种筛选克服第一个缺点；用混合营养培养（即异养培养时加光照）和异养-光自养串联培养可部分克服第四个缺点。由上可见微藻异养具有明显的优势，其大规模培养中存在的问题，可借用生化工程领域中较为成熟的微生物培养技术来解决。第20页/共40页混合营养（兼养）培养：微藻在有光照的条件下，既利用CO2进行光合作用又利用外源有机物生长。

异养-光自养串联培养：微藻先进行异养培养，然后进行光自养培养以提高藻细胞品质。第21页/共40页微藻光自养培养系统

微藻光自养培养有开放式、半封闭式与封闭式等几种方式，培养系统包括天然湖泊、敞开式跑道池、管道式或平板式等形式的光生物反应器。一般采用机械、鼓泡或气升循环等搅拌方式。敞开式跑道池培养系统封闭式光生物反应器生产系统第22页/共40页藻种的分离纯化1.微藻藻种的分离

从天然水域运用一定的方法，将微藻筛选分离出来，获得单种培养。1.1藻种的采样（1）采集所需要分离的藻种水样，个体较大的浮游藻类，利用浮游生物网在水中捞取；（2）个体较小的种类，通过超滤、离心等方法处理；（3）应注意采集海岸上留存下来的小水洼；（4）分离底栖硅藻，可刮取潮间带的“油泥”，加海水搅拌后，弃去泥沙后用筛绢滤去大型藻类和杂质。第23页/共40页1.2预备培养（1）培养液：根据所需分离的藻类，配制不同的培养液。预培养的营养盐浓度要低些。对于一些难以培养的种类，最好加入土壤浸出液。如藻种类较多，应使用几种不同的培养液；（2）预培养容器：250ml三角瓶1.3分离方法（1）离心法（2）趋向运动法（3）稀释法（4）平板分离法（5）毛细吸管法第24页/共40页2.微藻藻种的无菌纯化

通过抗生素抑菌和平板法相结合进行无菌纯化。在弱光下进行培养。第25页/共40页

第三部分光生物反应器第26页/共40页一、微藻大规模光自养培养特点分析

微藻大多为光能自养型生物，与我国生化工程领域过去所研究的异养型（一般为好氧）生物大规模培养相比，微藻大规模自养培养具有一些新的特点。第27页/共40页

微藻培养用光生物反应器，必须要用光照。对于外部光源的反应器，就要求反应器的比表面积很大，培养液的深度必须尽可能的小，否则藻体就得不到充足的光照；此外，为了充分利用自然光，反应器必须放在户外，而户外的光照条件随地域及天气而变化，因而培养条件基本上无法控制。对于采用内部光源的反应器，则需要在反应器的内部加上一个复杂的光照系统，藻体易附着在光源上且光源产热会给温度控制带来困难。所有这些问题在常规生物反应器中均不存在。第28页/共40页从混合角度来看，在微藻培养过程中的混合除了具有促进气液传质、液固传递、温度与营养均匀分布、防止藻细胞沉降等作用外，还必须使藻细胞在与光反应器表面垂直的这个方向上要能充分混合，否则由于在藻液中存在着严重的光衰减现象，培养液中的藻细胞受光就不均匀。第29页/共40页从气液传质角度来看，在微藻自养培养过程中，必须供应大量的二氧化碳，即要强化二氧化碳吸收过程；同时又要将藻细胞产生的大量氧气从培养液中排出来，即要强化氧解析过程。而在好氧生物培养过程中，要向培养液中供应大量氧气，即要强化氧吸收过程；同时要将好氧生物产生的二氧化碳从培养液中排出，即要强化二氧化碳解析过程。由此可见，微藻培养过程中氧和二氧化碳的传递方向与常规的好氧生物培养过程正好相反。第30页/共40页从培养液性质来看，好氧生物培养基大多用淡水配制，而微藻（淡水藻例外）的培养基多用海水配制。由于二氧化碳和氧在海水及淡水中的溶解度差别很大，且培养液中的藻细胞较低，因而微藻培养系统中的气液传质过程将出现许多新的问题；此外，海水对一般的材料具有腐蚀性，因而所用设备在材料选择上又会遇到新的问题。第31页/共40页

尽管微藻自养培养过程会出现上述新的特点，但其中所涉及到的基本问题仍同好氧生物培养过程相似，如传递问题、流体力学问题、在线检测与自动控制问题、培养动力学问题、过程优化放大问题等。由上可见，借鉴我国生化工程已有的知识和方法，来解决微藻大规模自养培养问题将是一条捷径。第32页/共40页二、敞开式和封闭式光生物反应器

微藻主要是光能自养生物，它是通过光合作用来生长的。微藻培养必须在光生物反应器中进行，该反应器要能提供以下条件：（1）合适的光照强度；（2）合适的温度；（3）合适的无机碳源及其它营养物质；（4）合适的pH值；（5）合适的混合；（6）合适的氧解析；（7）避免污染。微藻自养培养用的反应器有两大类：一类是敞开式反应器，另一类是封闭式光生物反应器。第33页/共40页1.敞开式反应器

在敞开式反应器中，典型且最常用的是敞开式跑道池，它是最古老的藻类培养反应器，且一直沿用至今。目前微藻的大规模培养主要使用这种反应器，这类反应器每个可大到几千平方米。第34页/共40页敞开式反应器的优点

敞开式跑道池反应器是国外于60年代设计出来的，至今变化较小。变化之处主要有两点：对其混合系统进行过一些改进(Lawsetal,1986)；利用传感器和计算机实现过程参数的在线检测和工艺优化。这类反应器的优点是成本低、建造容易、操作方便。第35页/共40页敞开式反应器的缺点

培养效率低。培养液中藻体浓度很低（一般约为0.1g/L），使得培养液体积特别庞大，这不仅使培养基成本及操作费用增大，而且会给藻体采收带来很大的困难；此外，因藻液深度约为20－30cm，因而反应器的占地面积大。培养条件无法控制。这是导致培养效率低的主要原因之一；此外，由于培养条件无法控制，使微藻的代谢产物无法大量积累，因代谢产物往往要靠外界条件的诱导才可大量积累。易污染。污染源于杂藻、水生动物、空气中的飘浮物等。这种污染不仅使得培养过程不稳定（甚至彻底失败），而且致使用这种反应器生产出来的产品也难以符合卫