PAGE测定蛋白质分子量

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PAGE测定蛋白质分子量

一、试验目的

1.理解SDS测定蛋白质分子量的原理2.把握垂直板电泳的操作方法

3.把握运用SDS测定蛋白质分子量

二、试验原理

带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。

蛋白质在普通PAGE凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、分子形状和所带电荷量。而SDS凝胶电泳在样品及电泳缓冲溶液中参与了SDS。

SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性解离成亚基，并且和蛋白质亚基结合成带负电荷的蛋白质-SDS棒状复合物。

当蛋白质样品中参与SDS后，由于SDS与蛋白质分子的结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，其电荷量远远超过蛋白质分子原来所带的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。同时，所有蛋白质-SDS复合物的形状均近似于长的椭圆棒，他们的短轴是恒定的，约1.8nm。而长轴与蛋白质分子量的大小成正比，从而又消除了不同蛋白质分子之间分子形状的差异。这样电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小，蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。可用下式表示：

lgM?A?B?dedo（de=样品迁移距离，do=电泳前沿距离，A、B均为常数）

以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，绘制出标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。

该方法快速、简便、分辩率高，在好多状况下超过超速离心、常用的层析及一般的电泳技术，是一种既经济又快速测量分子量的方法。并且所需样品少，可同时测定多个样品，是试验室常用的蛋白质分子测定方法之一。

三、试验所需的试剂与仪器（一）试剂

1.凝胶贮备液

丙烯酰胺29.2g和亚甲基双丙烯酰胺0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。

2.分开胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCl，pH8.8。

18.15gTris，少许重蒸水溶解，用1MHCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

3.浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。

6gTris，少许重蒸水溶解，用1MHCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

4.10%SDS，室温保存。

5.2倍还原缓冲液（2×reducingbuffer）溶液体积0.5mol/LHCl，pH6.82.5ml甘油2.0ml质量浓度10%SDS4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇1.0ml总体积10ml6.电极缓冲液，pH8.3。Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。7.低分子量标准蛋白质。

开封后溶于200μl重蒸水，加200μl2倍样品缓冲液，分装20小管，-20℃保存。临用前沸水浴3min，其相对分子量（Mr）如下：蛋白质相对分子量兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌动蛋白43000牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制剂20230鸡蛋清溶菌酶144008.质量浓度为10%过硫酸铵：（临用前配制）9.染色液

0.25g考马斯亮蓝R250，参与40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。

10.脱色液

50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml重蒸水混合。11.待测蛋白样品。

12.1%琼脂糖（最好用电极液配）13.TEMED

（二）器材

1.直流稳压电泳仪。

2.垂直平板电泳槽（含玻璃板、夹条、梳齿、夹子等）。3.移液器（5.0ml、1.0ml、200μl）。4.微量注射器（20μl、100μl）。

5.烧杯、培养皿、试管、滴管、直尺。6.脱色摇床

四、操作方法

1.将所需器材洗净晾干。

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好，并1%琼脂糖封玻璃板两侧及底部。3.按比例配好分开胶，用移液管快速参与，大约5厘米左右，之后加少许蒸馏水，静置40分钟。（胶与水层之间形成明了的界面）

分开胶的浓度12%重蒸水/ml1.5MTris-HCl(pH8.8)/ml10%SDS/ml凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml10%过硫酸铵/μlTEMED/μl总体积/ml3.352.50.14.0505104.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳参与浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置40分钟至浓缩胶完全聚合。

浓缩胶的浓度5%重蒸水/ml0.5MTis-HCl(pH6.8)/ml10%SDS/ml凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml10%过硫酸铵/μlTEMED/μl总体积/ml2.921.250.050.825555.拔出样梳后在上槽内参与缓冲液，用电极缓冲液冲洗加样孔数次。上槽缓冲液液面要高过点样孔，下槽要没过电极，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。

6.点样标准管样品管样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合蛋白溶液10μl(标准蛋白)10μl(待测蛋白样)2倍样品缓冲液10μl10μlEP管内混匀最终上样量20μl20μl7.接上电泳仪，上电极接电源负极，下极接正极。开启电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分开胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，中止电泳。

8.撬开玻璃板，将胶防备取出，置于一大培养皿中，参与染色液，染色1小时（摇床，37℃）。

9.倾出染色液，用蒸馏水漂洗数次后，参与脱色液脱色（摇床，37℃），每脱色15min后换一次脱色液，直至背景明了。

10.用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分开胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率（R）：

相对迁移率=样品迁移距离（cm）/指示剂迁移距离（cm）

以标准蛋白质Mr的常用对数（lgMr）对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算出其相对分子量。

1.固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。

2.凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再参与，否则凝结后无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。

3.水封的目的是为了使分开胶上沿平直，并排除气泡。4.样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。

5.为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。

6.剥胶时要防备，保持胶完好无损。

7.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必需同时作准曲线。不能利用上次的标准曲线作为本次使用。

8.有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组的，它们在巯