实验三酪蛋白含量测定

Quantitationofcasein

——Folin-phenolmethod实验目的

学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。

进一步掌握分光光度法。实验原理

（一）蛋白质定量检测方法

凯氏定氮法（Kjeldahldetermination）双缩脲法（Biuretmethod）Folin－酚试剂法（Folin-phenolReagentMethod）紫外吸收法（UVspectrophotometry）考马斯亮蓝法（Coomassiebrilliantbluestaining）BCA法（Bicinchoninine

acid

assay）1.凯氏定氮法

1.有机氮变成无机氮

样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品的氮含量。

NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)

2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4(2)

(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3(3)

2.蛋白质含氮量

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25。

2.双缩脲法

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），铜离子与肽键配位，配合物呈紫色。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为0.5-10mg/ml。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。干扰物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此此法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。3.考马斯亮蓝法考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。配置方法：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m195%乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml即可。考马斯亮兰G-250在酸性溶液中主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为25～200μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

干扰因素较少，氨基酸、肽、EDTA、Tris、糖等对其无干扰。主要的干扰物质有：去污剂、

Triton

X-100、SDS和NaOH。4.BCA比色法

在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA试剂（4，4´-二羧酸-2，2´-二喹啉钠）生成紫色复合物，于562

nm由最大吸收，其强度和蛋白质浓度成正比。

此法是一种较新的、高敏感度的蛋白测试法，其优点是单一试剂、终产物稳定，几乎无干扰物质的影响，尤其是在TritonX-100，SDS等表面活性剂中也可以测定。其灵敏度范围一般在10～1200ug/ml，应用更加灵活。5.紫外吸收法

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280

nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。利用该正比关系，即可测定蛋白质的浓度。

本法对于测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质误差较大，故适用于测定与标准蛋白质酪氨酸、色氨酸这类氨基酸含量相仿的样品。

由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH变化而改变，故应用此法时要注意溶液的pH。最好样品的pH与标准曲线制定时的pH一致。该法迅速、简便、不消耗样品、低浓度盐类不干扰测定，可测定0.1～0.5mg/mL的蛋白质溶液。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH变化而改变，故应用此法时要注意溶液的pH。最好样品的pH与标准曲线制定时的pH一致。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。如核酸。此时运用280/260吸收差法则可以适当校正核酸对蛋白质浓度测定的干扰作用。蛋白质的浓度（mg/ml）=1.55A280-0.75A260A280/A260=1.8（二）Folin—酚试剂法（Lowry法）

1.原理2.Lowry法的优缺点优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。(三)

分光光度计

1.原理

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=-log(I/Io)=-lgT=kLc式中:A为吸收度；Io为入射的单色光强度；I为透射的单色光强度；T为物质的透射比；k为吸收系数；L为被分析物质的光程；c为物质的浓度1.打开仪器开关，预热20分钟。2.用“波长没置”旋钮调整测试波长。3

.打开样品盖，将遮光体置入样品架中的第一格。4.取一支比色杯，加入作为空白对照的溶液，将上述比色杯放入样品架的第二格。5.取另一个比色杯，加入待测溶液，并将其放入样品架的第三格，关上样品盖。6.按动功能键，切换至透射比模式，拉动比色杆至1档，再按下“调0%”键，仪器显示“-.000”。7.将比色杆拉至2档，按下“调100%”键，仪器显示“100.0”完成调百。8.按下功能键，切换至吸光度模式，继续将比色杆拉至3档，读出仪器显示的数字。2.使用方法实验方法

上表中第一项1-7号管为标准蛋白溶液，8-9号管为层析样品溶液。各管立即摇匀，在室温下放置15min,以1号管为对照管，于500nm处比色。记下1-7管吸光度，做吸光度-酪蛋白浓度曲线。对8-9号