卫生微生物检验资料 第1章 细胞培养技术-11级

活细胞来源体外细胞培养鸡胚实验动物病毒特性只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸第一章细胞培养技术细胞培养技术(cellculturetechnology)模拟体内的生理环境条件,提供细胞适宜的营养条件和温度,在无菌操作的基础上,使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术。通常所说的组织培养(tissueculture)包括：

器官培养、组织培养和细胞培养。第一节细胞培养技术在病毒学

研究中的发展体外培养的组织细胞的优点：1.为培养病毒提供了生理特性基本一致的实验材料,且对病毒易感性较为接近;2.一块组织可产生多个部分,每部分都相当一个实验动物或鸡胚,经济方便;3.可消除实验动物中存在的病毒特异性抗体或非特异性抑制因子对病毒培养的影响;4.对体外组织细胞培养易进行无菌操作;体外培养的组织细胞的优点：5.多数情况下,病毒的细胞培养都能显示病毒增殖特征,如细胞病变,而不需其他指示系统证实病毒是否增殖;6.可通过许多其他检查方法来判断病毒的类型,如血球吸附试验,病毒干扰现象,免疫荧光试验,核酸杂交及原位杂交试验等;7.组织细胞培养病毒除可进行定性检测外,还可进行定量分析,如空斑试验和测定50%组织培养感染剂量(TCID50);8.细胞培养技术与免疫学及分子生物学技术结合为病毒快速检测提供了技术支持;第二节细胞培养概述一、体外培养细胞的生物学特性

(一)体外培养细胞组织来源

1.胚胎或成体组织

2.正常或肿瘤组织

1.胚胎或成体组织胚胎组织:

优点：含有大量前体细胞和胚胎干细胞，在体外生存和增殖能力较强,因此常应用人或动物的胚胎组织来制备原代细胞。缺点：胚胎组织中未分化细胞会继续分化,往往不能推测这些未分化细胞完全分化为成熟体细胞的类型,对组织细胞培养的一致性会产生影响。成体组织:细胞大部分为已分化细胞,在体外增殖困难,且生命周期短2.正常或肿瘤组织:正常组织:

高度分化，细胞分裂停止。体外培养细胞有一定寿命,一般从正常组织获得的细胞培养物常为有限传代细胞系。但某些连续细胞系如MDCK细胞(狗肾细胞）、3T3细胞（鼠胚胎成纤维细胞）是由正常组织细胞转化而来的,获得了细胞永生性,这种正常组织转化的细胞不具有致癌性。肿瘤组织:分化能力低,增殖能力较强,是获得无限细胞系的主要来源。

Hela细胞---人宫颈癌上皮组织

Hep2细胞---人喉癌细胞1.细胞异质性：从组织分离的原代细胞是一群对原有组织有较好代表性的细胞，但细胞间存在异质性，即差异性。来源于不同组织的细胞存在差异，来源于相同组织的细胞也存在差异。通过细胞克隆技术或流式分选细胞技术对细胞群中特有的细胞进行筛选，可以得到较纯的细胞群，建立标准的细胞株或细胞系。(二)体外培养细胞的生物学特性2.细胞的增殖和分化：在体外培养的细胞具有不同程度的增殖和分化能力，但易受多种因素的影响,包括营养物质、激素、细胞和基质间关系以及细胞密度。体外培养细胞条件如果适合于细胞数量的增加，往往不利于细胞分化。反之，适合于细胞分化的条件，往往不利于细胞增殖。

（1）贴壁型生长（2）悬浮型生长３.细胞生长特征与形态：

（1）贴壁型生长:细胞形态：①呈扁平不规则多角形、中间有核的上皮样细胞型;②呈梭形或不规则三角形的成纤维细胞型。贴壁型细胞特点：接触性抑制：15页密度抑制：15页人胚肺细胞（成纤维细胞型）（a)Hela细胞（b)

中国地鼠卵巢细胞上皮样细胞型人胃腺癌细胞绿猴肾细胞DH82细胞（犬巨噬细胞）

某些细胞在培养器皿中生长时不贴壁,呈悬浮状态,如淋巴细胞、白细胞及部分肿瘤细胞,细胞呈圆形。悬浮培养细胞培养空间相对大,细胞能大量增殖,适合大规模细胞培养,而且便于细胞传代。（2）悬浮型生长:半贴壁型:Sp2/0、YAC-1(三)体外培养细胞生长增殖过程细胞周期细胞一代生存周期细胞的生命周期间期M期（有丝分裂期）G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期）细胞周期１.细胞周期：单个细胞分裂增殖的过程。2.细胞一代周期概念：在细胞培养系统中,单个细胞经过多个细胞周期增殖而成为相互依存的一群细胞。形成的细胞群最终会达到一定密度,由于空间和营养等条件限制，细胞会停止分裂增殖，为了保持细胞继续分裂增殖则需要传代培养,即把原培养瓶中的细胞密度降低,转接到另一个培养瓶中。两次传代接种间隔的时间为一代时,而转接的次数为代次,每一代大约经历3－6个细胞周期。一代时：与细胞数量和细胞周期有关。一代周期：四个阶段

迟缓期、对数期、平衡期和衰亡期（1）迟缓期

概念：细胞接种到培养瓶后,并不是立刻贴壁,而是游离或悬浮一段时间后才吸附于瓶壁上。----环境适应

初代培养的细胞:贴壁较慢,约10～24h。

连续细胞系：贴壁较快,约30min即可完成贴壁。(2)对数生长期:概念：细胞经过环境适应过程及细胞物质积累后,开始增殖分裂。

增殖细胞数＞死亡细胞数一般细胞贴壁后培养24～72h即可进入对数分裂期,大约可持续3～5d。特点：整个细胞群最具活力,对药物也最为敏感,病毒分离培养或药物试验常选处于此期细胞。(3)平衡期:概念：经过快速增殖的对数生长期,贴壁生长细胞会由于彼此间接触而抑制细胞继续延伸。而营养和空间竞争及代谢产物有害作用,导致细胞分裂相减少,代谢活动减慢,

增殖细胞数目=死亡细胞数。特点：

细胞界限不清晰,胞浆内颗粒增多,细胞不太透明。培养液变酸,指示剂偏黄色,提示需更换培养液。(4)衰亡期:

细胞经过平衡期,由于营养物质的进一步消耗,有害代谢产物积累增多,对细胞损害加大,细胞停止分裂。

死亡细胞数>存活细胞数。单层细胞间开始出现空隙,有的细胞开始皱缩脱落。3.体外培养细胞的生命周期原代培养期传代培养期衰亡期培养细胞的生命周期原代培养期传代培养期衰亡期新鲜组织自体内取出并分散成单个细胞接种于培养瓶，在体外培养生长至第一次传代的时期。某些原代培养的细胞生长一定时间之后，便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。对于原代培养细胞和有限传代细胞来说,细胞分裂次数是有限的，进入衰亡期的细胞增殖慢或不增殖,最终由于衰退而出现凋亡,即程序化死亡。原代培养细胞有限传代细胞无限传代细胞原代培养期衰亡期原代培养期原代培养期传代培养期传代培养期衰亡期(四)体外培养细胞的基本条件细胞接种营养物质酸碱度气体条件温度水的纯度抗生素1.细胞接种将细胞密度调整至104~105/ml。尽量选择对数生长期细胞接种。2.营养物质天然培养液中的营养成分：包括血清、组织浸出液、淋巴液等;合成培养基的主要成分包括无机盐、微量元素、维生素、碳水化合物、脂肪、氨基酸、蛋白质、激素和生长因子等。如RPMI1640，DMEM培养液等。3.酸碱度pH范围是6.6~7.8，最适pH为7.0~7.4,缓冲系统：主要是CO2-NaHC03系统，类似于血液系统。细胞接种初期pH要稳定，最好为7.4，培养过程中不能下降至7.0，当下降至6.8时会抑制细胞的生长。4.气体CO21.用于调节细胞培养液的pH;2.用于合成细胞物质，在密闭培养状态细胞（例如橡胶塞塞紧的细胞培养瓶）本身呼吸产生的CO2即可满足其生长需要，而开放培养系统（例如96孔培养板）往往需要提供5%的CO2。5.温度:

细胞耐冷不耐热,最适宜生长的温度为35～37℃。6.水:

细胞对用水要求较高,一般要求去离子水或三蒸水.

现在实验室采用纯水器对纯化.水作超纯处理,出水电阻率可以达到18.2MΩ,更适宜细胞培养。7.抗生素

因为细胞培养液营养丰富,经常会有微生物污染,如细菌、真菌、支原体等,在培养液中加入抗生素可抑制微生物生长。抗生素不应对培养的细胞本身产生毒性作用。青、链霉素或庆大霉素--抑制细菌生长两性霉素--控制真菌污染卡那霉素--控制支原体污染二、组织细胞培养种类自学三、细胞系的建立、保存和鉴定(一)细胞系和细胞株的概念1.细胞系(cellline)：原代培养物经传代培养获得的一群细胞,包含有多种细胞成分,根据其生存期分为有限细胞系和无限细胞系。2.细胞株(celistrain)：从原代培养物或细胞系中获得的遗传、生化特性相同的细胞群（如对某种病毒的敏感性或抗性,具有特殊的抗原性等），这些特性在传代培养中保持不变。亚株：某些细胞在体外培养过程中，会在某些遗传性状上发生改变，这种与原细胞株存在不同的细胞群称为亚株。(二)细胞系或株的相关信息记录

要说明所建细胞系使用的培养基、血清来源和浓度,还要说明适宜的培养条件细胞培养来源细胞生物学特性培养条件和方法包括物种、年龄、性别、所采取的组织或器官记录细胞的形态、结构、生长曲线和分裂指数、倍增时间、集落形成率或贴壁率等。对肿瘤细胞,需要做异体动物接种致瘤性及对正常组织浸润能力实验,确证细胞系是否来源于原肿瘤组织,并保持致瘤性和浸润性。(三)细胞系或细胞株的鉴定内容自学四、用于病毒培养的细胞选择1.细胞对病毒的敏感性2.研究目的3.研究病毒在不同组织细胞培养中特性4.病毒培养方法1.细胞对病毒的敏感性容纳细胞(permissivecell)：病毒对感染的细胞具有严格的选择性,首先细胞要具有与病毒结合的受体,病毒才能吸附到细胞表面,然后进入到细胞中,由细胞提供病毒复制增殖必要的酶及能量,这种细胞又称容纳细胞。来源于易感动物组织的原代细胞,培养易感病毒最为适宜。病毒在体内和体外对细胞易感性并不完全相符。2.研究目的根据研究目的不同选择不同的细胞株或系。3.研究病毒在不同组织细胞培养中特性

一种病毒在不同组织细胞培养中可表现不同特征。了解某种病毒在不同细胞培养中增殖特征,有助于鉴定病毒。4.病毒培养方法(1)静止培养：

用于悬浮生长和贴壁生长的细胞。(2)旋转培养：使贴壁细胞间歇式离开培养液的浸泡,以利于细胞呼吸和物质交换,少量培养液中能够增殖大量细胞。(3)悬浮培养：

还有些细胞需要搅拌呈悬浮状态才能生长,可以使细胞处于相同的条件下,保持对数生长期,细胞浓度能达到107～108/mL。第三节细胞培养技术一、细胞培养的基本设施与条件二、无菌操作技术和细胞检查技术三、原代细胞制备过程四、传代细胞制备及培养技术五、细胞的冻存、复苏及运输一、细胞培养的基本设施与条件(一)细胞培养常用设备和器材1.实验设施与设备：包括无菌室、超净台或生物安全柜、倒置显微镜、C02孵箱、离心机、普通冰箱、液氮罐以及高压蒸汽灭菌器、干烤箱、恒温水浴箱、过滤除菌装置等。2.实验器材的选择：包括培养瓶、培养板、离心管、吸管等。(二)实验器材的处理主要包括清洗(去污、去有机物、去离子)和无菌处理过程。1.玻璃器皿的处理2.胶塞及其处理3.滤器及其清洗灭菌滤器1.玻璃器皿的处理原则：要保证玻璃器皿透明、无划痕，不能有任何对细胞有害物质残留。处理过程：(1)清洗过程(2)包装与灭菌(1)清洗过程：浸泡→刷洗→酸浸→冲洗1)浸泡：对用过的器皿：如果有污染需要灭菌处理,冲洗后在酸槽中浸泡过夜,再进行清洗。新的玻璃器皿：一般呈弱碱性,可以用自来水浸泡、冲洗,再用2%的盐酸浸泡过夜,然后用水洗。2)刷洗：选择软毛刷和无毒的洗涤剂，对玻璃器皿洗刷,进一步去除污渍,然后冲洗烘干。3)酸浸：将干燥的玻璃器皿投入清洁液中（含重铬酸钾和硫酸）浸泡过夜，清洁液的强氧化作用可清除刷洗不掉的微量污渍。

常用清洁液洗液为强酸,要注意洗液的失效性,新配制的是棕色,变为绿色则失效。

4)冲洗：先用流动的自来水反复冲洗,然后再用蒸馏水反复漂洗3次,不能残留有害物质,烘干。(2)包装与灭菌：包装：

吸管：塞上小块棉塞,装入牛皮纸袋或专用的金属筒。

培养瓶、盛装液体的玻璃瓶：瓶口进行适当包装。灭菌：可用高压蒸汽121℃、灭菌20min，然后低温烘干。或直接干烤160℃，2h（注意锡箔纸包装）。2.胶塞及其处理细胞培养用胶塞：应能耐高压、有弹性、对细胞应无毒。胶塞：新胶塞：使用前要用2%NaOH煮沸15min,再用4%的HCl煮沸15min,用自来水反复冲洗，用去离子水冲洗或浸泡过夜。用过的胶塞：先经高压蒸汽灭菌,然后再用洗涤剂清洗或刷洗以去除附着的蛋白等物质，再重复以上步骤。3.滤器及其清洗滤器：用于不宜进行高压灭菌的液体除菌，如某些含酶的消化液、血清等。常用滤器：蔡氏滤器玻璃滤器针头滤器蔡氏滤器正压滤器过滤除菌一般用0.22um滤膜正压滤器工作原理玻璃滤器：型号G1-G6G1~G4型：滤板（砂芯）孔径5~200μm,常用于液体初滤;G5型孔径2~5μm,可除去液体中部分细菌;G6型小于2μm,一般为0.22μm，用于过滤除菌。G6滤板培养液真空泵软管抽气瓶软管软管（三)细胞培养常用试剂和培养液1.水：组织培养必须使用三次蒸馏水或超纯水(电阻率可达到18.2MΩ)。2.常用试剂平衡盐溶液消化液抗生素pH调整液指示剂(1)平衡盐溶液

常用平衡盐溶液：目前常用的有Hanks液、Earle液和磷酸盐缓冲液(PBS)等。作用：

①为细胞生长提供无机离子。②对保持溶液渗透压、缓冲酸碱度起着重要作用。③某些离子还是酶的活性成分。主要用途

①配制细胞生长液的基础溶液;②配制含胰蛋白酶消化液等;③在制备原代细胞和传代培养时,用于洗涤组织和细胞。在制备平衡盐溶液时需注意的问题:①避免钙离子的沉淀：将平衡盐溶液(BSS)先配制成浓缩液,CaCl2单独配制,临使用前再混合;②保持良好的缓冲作用：Hanks液、Earle液需要C02调节平衡,配制好的溶液要避免C02丢失,应使用橡胶塞盖紧;③平衡盐溶液试剂纯度应为分析纯(AR)以上。(2)消化液水解细胞间蛋白质,使细胞分散成单个细胞胰蛋白酶EDTA胰酶-EDTA联合制剂胶原酶根据细胞特性及经验。作用常用消化液消化液的选择1)胰蛋白酶原理：水解蛋白质，使细胞间质水解,达到细胞分散目的。

胰蛋白酶的活性：常用解离酪蛋白的能力表示,常见的有1∶125和1∶250两种。使用浓度及作用条件：0.25%或0.125%,在37℃或室温使用,pH为7.6消化效果最佳。注意：酶活性可被动物血清灭活。

2)乙二胺四乙酸钠原理：是一种鳌合剂,可与保持组织完整性的Ca2+、Mg2+离子结合,从而使细胞分散脱离,特别是上皮组织。特点：毒性小、价格便宜、使用方便。消化作用不受血清的抑制。使用浓度：为0.02%。EDTA主要用于消化传代细胞。3)胰酶-EDTA消化液原理：联合使用对细胞的分散能力更强。使用的终浓度：0.25%的胰酶和0.02%的EDTA,滤过除菌,分装后于-20℃保存备用。应用：这种混合液对上皮类细胞进行消化,效果较好,在实验室广为应用。(3)抗生素①防止细菌污染--青、链霉素和庆大霉素

青霉素终浓度100U/ml

链霉素终浓度100ug/ml

庆大霉素终浓度10-100ug/ml②防止霉菌污染--两性霉素和制霉菌素

一般不常规用于细胞培养③防止支原体污染--卡那霉素和金霉素等。

卡那霉素浓度为100ug/ml(4)pH调整液作用：调节pH值。合成的培养液：pH值偏酸,而细胞生长的最适pH为7.0～7.2,因此需要调节培养液的pH值。

胰蛋白酶：最适pH值7.6。常用的调节剂：NaHCO3溶液。HEPES缓冲剂：羟乙基哌嗪乙硫磺酸

(5)指示剂作用：用于培养液中pH值的指示酚红：0.4%的酚红溶液

pH6.8为黄色

pH7.8为紫红色

pH7.0～7.2为桃红色3.常用培养液（1）天然培养液（2）合成培养液（3）无血清培养液（1）天然培养液概念：主要指来自于动物体液或组织分离的提取物。主要有血清、血浆、胶原等,以血清应用最广。特点：成份复杂，往往存在差异，对细胞培养的恒定性有影响。血清主要来源：牛、马、兔及人。目前应用较多的为牛血清，多为商品化生产。商品化的牛血清

小牛血清：出生10～30d小牛犊牛血清：出生24h内或未哺乳小牛胎牛血清：剖腹产小牛，质量最好注意：使用前56℃水浴30min，灭活补体。做无菌试验。1)血清的主要作用①提供基本营养和结合蛋白②提供激素及各种生长因子③提供促进细胞贴壁的蛋白④提供抗损害的保护性物质⑤提供蛋白酶抑制物质⑥提供pH缓冲物质。2)使用血清存在的问题血清可促进成纤维细胞生长而抑制表皮角质细胞生长血清常有细胞毒作用，如细菌毒素、脂类以及多胺氧化酶、补体、抗体等由于血清经常来源于不同动物，很难保证批与批的一致性，更换血清时往往需要用相应细胞作培养血清含有的特殊细胞因子对于某些种类的细胞可能过多或不足，多了有害，少了又不能满足细胞生长需要。(2)合成培养基主要有MEM、Eagle、DMEM、RPMI1640及199培养液等基础培养基。添加血清，主要为牛血清。通常添加5%~10%的血清为细胞生长液添加1%~2%的血清为细胞维持液。(3)无血清培养液(serumfreemedium,SFM)概念：不添加血清等天然成分,主要由成分完全明确的基础培养基和附加成分组成。根据细胞的不同,添加针对某种细胞生长的特异性生长因子、激素、细胞附着蛋白、金属离子转移蛋白、细胞结合蛋白、酶抑制剂和微量元素等。目前尚无一种可广泛应用各种细胞的成分完全清楚的无血清培养液。二、无菌操作技术和细胞检查技术

三、原代细胞制备过程

四、传代细胞制备及培养技术自学五、细胞的冻存、复苏及运输

细胞在体外培养,多次传代易引起细胞株发生变异、衰退,甚至污染,为了保持细胞生物学性状的恒定性,一般在10代以内即需要对细胞进行冷冻低温保存。当需要使用细胞时,再对冷冻细胞株进行复苏。有时实验室间会有细胞株交换,还涉及细胞运输问题。（一）细胞的冻存概念：将细胞悬液与冻存液混匀,置于低温条件下,按一定程序进行冷冻,然后置于-70℃低温冰箱或-196℃液氮罐中,细胞可长期保存。冻存过程：缓慢冰冻

保护剂：甘油和二甲基亚砜(DMSO)

原理：冻存液降低冰点,可减少细胞内外冰晶形成,可保护细胞在冻存过程中较少受到伤害。

冻存液：含10%DMSO，20%牛血清的培养液（70%)细胞冻存过程1.器材和试剂(1)冻存管：2ml(2)冻存液：10%DMSO，20%血清的生长液(3)装有液氮的液氮罐。-80℃冰箱。（4）冻存盒：

周围有异丙醇，把冻存盒放到-80度的冰箱里，盒内温度成线性下降-1℃/分的冷冻率。2.冻存方法(1)选择对数期生长的细胞,在准备冻存细胞前24h进行换液(2)用消化液将生长好的细胞进行消化处理,离心沉淀,去除上清液,制得单细胞悬液。(3)然后将此细胞悬液悬浮于含有保护剂(DMSO)的生长液中,使细胞浓度保持在106/ml。(4)将需要冻存的细胞悬液分装在冻存管中,并做标记。(5)冻存细胞可有人工方法和冻存器方法,可将冻存管在4℃放置4h或过夜,然后转放-20℃数小时直到冻结,再置于-70℃以下长期保存。或4℃放置4h,然后放入液氮罐中层4h,最后再沉入液氮中。(二)冻存细胞的复苏

原则：

复苏时的温度和融化速度对细胞活力恢复有影响,应在高于室温条件下（37℃）尽可能快速融化,以免在溶化过程中形成冰晶。冻存细胞的复苏程序1.迅速取出冷冻管,立即放入37～40℃水浴中,使其迅速融化。2.无菌操作将含冻存细胞的冷冻液移至新的离心管内,向离心管内加入3倍原体积的25℃生长液。3.离心细胞,以1000r/min的速度,离心10min。4.弃掉上清,将生长液加入离心管内,用吸管反复吹吸以悬浮细胞。将悬浮细胞吸到培养瓶内,补足生长液后,置5%C02孵箱,于37℃培养。5.刚复苏的细胞,生长会受到影响,经传代后可逐渐恢复正常,最好在传代次日换液一次。（三）细胞运输为了防止运输过程中液体震荡，可将培养瓶充满液体。第四节细胞培养污染与监测自学第五节细胞培养技术在病毒学检验中的应用分离培养病毒病毒性疾病的血清学诊断肿瘤病毒致癌机制研究药物体外抗病毒实验一、分离培养病毒(一)常用敏感细胞原代细胞：敏感性较强,对原有组织更具代表性。但由于原代细胞不能多代培养,制备技术麻烦,应用受限。二倍体细胞和长期传代细胞：在对病毒的分离培养方面应用更为广泛。一种病毒往往对多种细胞敏感。(二)标本前处理固体样本：如动物脏器或组织块,可用组织匀浆器或乳钵将其制成匀浆,加入Hank’s液稀释10倍,将该组织悬液在2500r/min,离心10min,取上清作为接种材料。液体样本：可直接离心沉淀去除颗粒杂质。如果怀疑接种材料有细菌污染,可加入适量青链霉素混合液,在4℃冰箱过夜后再进行接种。（三）标本接种与培养方法1.敏感细胞单层培养：选择敏感细胞株，将其培养为单层细胞，可用于标本接种。2.标本接种：将细胞培养瓶中营养液倒出,将准备好的病毒悬液接种于单层细胞培养瓶中,放置37℃下1h,使病毒吸附到细胞上,每隔15min轻摇培养瓶,以利于病毒均匀接触细胞。同时以Hanks液代替病毒悬液作对照,然后加入适量维持液,培养,逐日观察细胞病变情况。(四)病毒鉴定方法1.细胞病变检查法2.红细胞吸附试验3.空斑试验4.中和试验5.电镜观察6.免疫荧光技术7.分子生物学技术1.细胞病变(cytopathiceffect,CPE)检查法

病变的类型主要有：细胞圆缩细胞聚合细胞融合形成合胞体等可根据细胞病变初步判定病毒的种类。正常MDCK细胞接种流感病毒的MDCK细胞2.红细胞吸附试验有些病毒能感染细胞，可使细胞具有吸附某些红细胞特性,如果将红细胞悬液加入已感染病毒的单层细胞,使其接触一段时间,在显微镜下可观察到红