疟疾镜检专题知识专家讲座

疟原虫镜检技术疟疾镜检专题知识专家讲座第1页一、显微镜镜检用于疟疾诊疗

显微镜镜检仍是当前广泛应用疟疾诊疗技术(金标准）主要优点

-特异高

-能区分虫种

-能分期

-能计数

-1小时内能完成诊疗程序疟疾镜检专题知识专家讲座第2页1.所需设备（1）载玻片（2）采血针

（3）玻片盒

（4）75％乙醇棉球（5）铅笔（6）记录表二、血片制作及染色疟疾镜检专题知识专家讲座第3页

2．血片制作（1）取血部位采血部位有指尖、耳垂、婴儿可在足跟取血（2）涂制血膜厚血膜涂制：

用推片左下角刮取血液4-5μl（约火柴头大小），将血滴涂于载片中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.8-1厘米厚薄均匀圆形厚血膜。疟疾镜检专题知识专家讲座第4页用棉球抹净角上血渍，再刮取血液1.5μl{约1/4火柴头大小)，将推片一端置于血滴之前，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25-35°角，从右向左快速向前推成舌状薄血膜，长约2.5CM。（一）薄血膜涂制：疟疾镜检专题知识专家讲座第5页（3）厚薄血膜位置：每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。标准血膜位置以下列图所表示。（4）血膜编号制成血片后，待薄血膜干后用铅笔将代号或个人编号写于血膜基部，编号要与登记本及结果汇报单上编号相一致，以防差错。疟疾镜检专题知识专家讲座第6页

标准血膜示意图

疟疾镜检专题知识专家讲座第7页（二）血片染色1．薄血膜固定血片完全干燥后才可染色固定方法：将涂片血膜面向上，厚血膜在上端，略倾斜放置，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上轻轻抹过以固定薄血膜。（注意：厚血膜不能固定）疟疾镜检专题知识专家讲座第8页2．染色用水和冲洗用水配制惯用中性蒸馏水或经煮沸过滤冷开水。用pH7.0～pH7.2缓冲液效果最正确。在没有蒸馏水情况下，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色很好。（1）两种贮备液配制：贮备液I1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液

Na2HPO49.5g

蒸馏水1000ml贮备液Ⅱ1/15M磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液

KH2PO49.07g

蒸馏水1000ml疟疾镜检专题知识专家讲座第9页（2）缓冲液配制PHM/15Na2HPO4M/15KH2PO4DW(ml)(ml)(ml)6.849519007.063379007.168329007.273279007.48119900加缓冲液PH可用试纸或0.02%酚红液测定。亦可用PH7.0中性蒸馏水稀释染剂疟疾镜检专题知识专家讲座第10页（1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：吉姆萨粉10g

甲醇500ml

甘油500ml

将吉姆萨粉置于研钵中，加入少许甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少许甲醇洗涤掉剩下部分并倒入瓶内，重复数次，一并倒入瓶中，至研钵中甘油洗净为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，在室温下放置3-5天，天天摇动，即可使用。放置时间越长染色效果愈佳。疟疾镜检专题知识专家讲座第11页（2）

染色方法：

A.

常规染色用PH7.0-7.2缓冲液或蒸馏水将吉氏原液与缓冲液1：20稀释。分别加数滴经稀释吉氏染液于厚、薄血膜，染色25-30分钟后，用中性蒸馏水轻轻将片上染液冲去，（冲洗时勿用水直接对准厚血膜，以免血膜脱落）凉干后镜检。疟疾镜检专题知识专家讲座第12页

B.

快速吉氏染色

在每毫升缓冲液中加吉氏原液3滴，（10-15%吉氏染液）分别加数滴于厚、薄血膜上，染色5分钟，用流水轻轻冲洗洁净，凉干后镜检。疟疾镜检专题知识专家讲座第13页瑞氏（Wright）染液:（1）染液配制：

瑞氏染剂粉0.1—0.5g

甘油3ml

纯甲醇97ml

将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，然后加入少许甲醇碾磨后倒入有玻塞瓶中，再分次用甲醇冲洗碾钵中瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。充分摇匀，普通放置一二星期后，再过滤应用（保留时间愈久，染色力愈佳）。急用时，放置24小时后过滤也可使用。

疟疾镜检专题知识专家讲座第14页（2）染色方法：

先用腊笔在厚薄血膜间画一界限，滴2-3滴蒸馏水于厚血膜上溶血,弃残液。（小心勿使蒸馏水超出腊笔线而触及薄血膜）。在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加与染液等量蒸馏水，与染液混合均匀后用玻棒引至厚血膜上，厚薄血膜同时染色5-8分钟后，用清水轻轻冲洗数秒钟，待干后镜检。

疟疾镜检专题知识专家讲座第15页3.染色质量

染色很好血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不应该出现蓝—绿色或红色）；镜检红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞核呈紫蓝色；疟原虫核呈红色，疟色素清楚可见，在显微镜下仅有小量染液沉淀。疟疾镜检专题知识专家讲座第16页4.影响血膜染色原因血膜染色好坏，除与玻片清洁、血膜制作技术等相关外，尚与以下原因相关：(1)试剂和溶剂质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使所配染液偏酸或偏碱，从而影响血膜染色。

(2)染液新旧：新配制染液，因色素还未充分溶解，普通染色力弱，且常带碱性。染液放置较久，染色力逐步增加，尤以吉氏染液为甚。通常在染液配制1-2周后才使用。

疟疾镜检专题知识专家讲座第17页(3)染液稀释浓度：染液浓度高，则着色快而深，各种细胞着色粗糙、薛氏点等粗大显著，但颜色偏碱；使用染液浓度低，染色时间长，则着色慢，颜色偏酸，各种细胞内部结构着色均匀、细致。

(4)染色时间与温度：染色时间长，化学反应充分完成，染色效果好，反之则染色效果差。疟疾镜检专题知识专家讲座第18页用水过酸可致受染RBC上点彩染不出来，用水过碱，则使薄血膜上RBC染成灰蓝色，致使R胞浆难以辨论。所以，当染色结果发生偏蓝（碱）或偏红（酸）时，可用酸碱度与之相反缓冲液冲洗血膜，给予调整。(5)稀释和冲洗用水：疟疾镜检专题知识专家讲座第19页疟疾镜检专题知识专家讲座第20页

血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等相关外，还受到以下几个原因影响：（1）染料溶剂质量染料、甲醇和甘油假如不纯，常使配制染液偏酸或偏碱而影响染色效果。所以必须用分析纯甲醇和中性甘油，而且在配制时所用器具必须洁净而无水份。疟疾镜检专题知识专家讲座第21页（2）染液新旧新配制染液因色素还未充分溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制1~2周后才使用，盛装染液瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。（3）染液稀释后使用时间染液主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红碰到美蓝和天青即产生沉淀。所以，必须在稀释染液当初使用，普通在半小时内染色力最强。疟疾镜检专题知识专家讲座第22页

（

4）染液稀释浓度与染色时间染液浓度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟原虫寄生红细胞薛氏点粗大显著，但颜色常偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些，颜色偏酸红，薛氏点不显著或消失。（5）稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色很好，应使稀释染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.0~pH7.2水稀释。当染色太蓝，可用pH较低缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，给予校正。疟疾镜检专题知识专家讲座第23页薄血膜中常见血液成份中性白细胞酸性球血小板大单核球淋巴球红血球疟疾镜检专题知识专家讲座第24页（三）厚薄血膜优缺点及其适用范围薄血膜用血量约为2μl，涂制成2cm宽×4cm长面积薄血膜。因为在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫形态保持完整，便于疟原虫虫种判定。惟因为用血量少，为确保检测敏感性，常耗时较多，似不适合用于大规模调查。即使在医院化验室，因为要求在短时间内作出诊疗，因而极有可能出现漏诊。疟疾镜检专题知识专家讲座第25页

厚血膜用血量约为10μl～20μl。涂制成直径1cm厚血膜因为在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆和胞核不可防止地形成一定程度固缩。受影响较大有大滋养体、裂殖体形态。在镜检厚血膜时，普通门诊须检验200~1000个油镜视野（相当于0.5~2.5μl血量），才能确保镜检敏感性和可重复性。通常敏感性可达约10~20个原虫/μl血。因为厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节约时间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜15～25倍。所以，我们推荐疟疾诊疗应以检验厚血膜为主。在普查时均应查完整个厚血膜，未查见疟原虫则判为阴性。疟疾镜检专题知识专家讲座第26页混合感染判别1、轻易判别混合感染1）同一血膜中发觉间日疟各期原虫和恶性疟雌雄配子体。2）同一血膜中发觉大量纤细恶性疟环状体，并混有少许间日疟原虫。2、不易判别混合感染1）间日疟各期原虫和粗环恶性疟环状体。2）仅有间日疟和恶性疟环状体。

3分子生物学方法应用于疟原虫分型1）提升检出：对镜检漏诊病人敏感性达5个原虫/100uL血2）确定四种疟原虫，做复核判定疟疾镜检专题知识专家讲座第27页

三、厚血膜疟原虫计数

依据预先测定白细胞数目计算出每微升血液中疟原虫数目。在制作厚血膜同时，使用Coulter计数器或血球计确定每微升血液中白细胞数。然后镜检厚血膜，计数同一视野中疟