盐胁迫对大豆种子萌发及生理的影响

盐胁迫对大豆种子萌发及生理的影响摘要：选取有代表性的中性盐NaCl,设置0、50、100、150、200mmol/L5个浓度水平，对山西普遍种植的大豆种子进行萌发胁迫处理，探讨大豆种子萌发期耐盐性以及耐盐机制。结果表明，低盐浓度(50mmol/L)对种子萌发有促进作用,而高盐浓度抑制萌发，且随着NaC1浓度的增高，抑制程度明显加重；胚根胚芽中SOD和POD活性呈先升高后降低的趋势，而Pro和MDA含量则呈逐渐增加的趋势。大豆种子在发芽和生理变化上均表现出一定的耐盐能力，相比较而言，POD在其萌发期抵御盐胁迫时起重要作用。关键词：盐胁迫；大豆；种子萌发；生理变化土壤盐碱化已成为世界性问题。目前，全球现有耕地中大约有3.4亿hm2为盐碱地［1］，而中国的盐碱土比例明显高于世界平均水平，近1/3的灌区土壤存在盐碱化问题［2］。盐碱化已成为制约我国农业生产的主要因素之一。豆科植物在我国各地均有栽培，其中被誉为“豆中之王”、“田中之肉”、“绿色牛乳”的大豆因其营养价值高、粮油兼用等特点而被广泛栽培。但是，土壤盐碱化日益加重，已经成为影响大豆栽种面积、产量及品质的重要因子。对于大多数作物而言，种子萌发和早期幼苗阶段对环境胁迫最为敏感［3］，因此对作物的耐盐性研究大都集中于对种子发芽率、萌发速率以及胚根、胚芽生长的影响［4-13］，而关于对萌发后胚根和胚芽生长危害的机理，以及为了抵御危害在生理上的变化等方面的研究却很少，尤其是关于以蛋白质为主要贮藏物质的大豆种子抗盐性的研究报道几乎没有。为此，以大豆种子为试验材料，采用不同浓度NaCl进行胁迫处理，通过统计种子发芽率等指标以及对相关溶质的测定，揭示大豆种子萌发期的耐盐性生理特性和适应机制，对于在盐碱地上种植大豆，力争全苗、壮苗，提高产量，增加效益以及对大豆的耐盐育种都具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料优质大豆种子购自山西省农业科学院。NaCl购自北京市鼎国昌盛生物技术有限责任公司。1.2试验设计根据预备试验，NaCl设置0、50、100、150和200mmol/L5个浓度梯度。选择均一饱满的种子，置于5层滤纸的培养皿中，每皿30粒，加入30mL处理液,4次重复，每皿覆盖5层纱布。纱布提前用对应的处理液浸润，然后置于25°C的恒温培养箱中培养6d，每天用称重补水的方法进行发芽试验，并记录每日的发芽数及发芽结束时的幼芽鲜重。1.3试验方法1.3.1萌发指标的计算方法发芽势=［（3d发芽种子数/供试种子总数）］x100%发芽率=［（7d发芽种子数/供试种子总数）］x100%发芽指数=工（Gt/Dt）（Gt为在发芽时段内每日的发芽种子数，Dt为相应的发芽时间）活力指数=GIxS（GI为发芽指数，S为发芽结束时的幼芽鲜重）盐害指数=［（对照组发芽率-处理组发芽率）/对照组发芽率］x100%1.3.2生理指标的测定方法发芽试验结束后，取出胚芽和胚根先用自来水冲洗，然后用去离子水冲洗，表面残留的水分用滤纸吸干待用。超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定参照李合生［14啲氮蓝四唑显色法，过氧化物酶（POD）活性的测定参照张龙翔等［15］的生化试验方法和技术，游离脯氨酸（Pro）含量的测定参照张殿忠等［16］的茚三酮显色法，丙二醛（MDA）含量的测定参照李合生［14啲硫代巴比妥酸比色法。2结果与分析NaCl胁迫对大豆种子萌发的影响从图1可以看出，随着NaCl胁迫浓度的增加，大豆种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数均呈先上升后下降的趋势。在NaCl浓度为0〜50mmol/L时呈缓慢上升的趋势，在盐浓度为50〜200mmol/L时呈下降趋势。当NaCl浓度达50mmol/L时出现最高峰，发芽势比对照增加了12.13个百分点，发芽率比对照增加了3.7个百分点，发芽指数比对照增加了1.12%，活力指数比对照增加了6.05%；当NaCl浓度达200mmol/L时，发芽势降低为39.17%，发芽率降低为60.00%，发芽指数降低为18.55，活力指数降低为119.46。与此相反，盐害指数随着NaCl胁迫浓度的增加呈先降低后增高的趋势，其中50mmol/L时盐害指数为-3.70%,之后随着盐浓度的增加呈现递增趋势，当NaCl浓度达200mmol/L时，盐害指数为33.33%。综合比较得知，在整个胁迫范围内活力指数的变化最显著，尤其是当胁迫浓度大于50mmol/L时，活力指数呈骤然降低的趋势，其余几个指标变化幅度不大。NaCl胁迫对大豆种子生理的影响2.2.1NaCl胁迫对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响大豆种子萌发期SOD活性随NaCl浓度的变化情况见图2。其活性变化呈现出先升高后降低的趋势。当盐浓度从0mmol/L增加到50mmol/L，酶活性随之增高；当NaCl浓度超过临界值（试验临界值为50mmol/L）而继续增大时，SOD酶活性随之下降。NaCl胁迫对过氧化物酶（POD）活性的影响如图3所示，随着NaCl胁迫浓度的增加，POD酶活性呈现先升高后下降的趋势，其临界值出现在NaCl为50mmol/L时，此时POD活性比对照增加了51.11%,当NaCl浓度达200mmol/L时，POD活性比对照降低了48.74%,总体变化趋势同SOD活性，呈现倒“V形，但较SOD变化剧烈。NaCl胁迫对游离脯氨酸（Pro）含量的影响不同浓度NaCl胁迫下大豆种子中游离脯氨酸的含量见图4。由图4可知，随着NaCl胁迫浓度的增加，游离脯氨酸的含量呈递增的趋势。各胁迫浓度下游离脯氨酸的含量比对照分别增加了17.72%、41.34%、56.30%和72.05%。2.2.4NaCl胁迫对丙二醛（MDA）含量的影响不同浓度NaCl胁迫下大豆种子胚中的丙二醛（MDA）含量见图5。由图5可知，丙二醛（MDA）作为膜脂过氧化产物，其含量随着NaCl胁迫浓度的增加呈逐渐升高的趋势，且NaCl浓度为50mmol/L时变化幅度较小，MDA含量仅比对照增加了7.39%，表现出一定的耐盐性；当NaCl浓度为100〜200mmol/L时MDA含量迅速增加，与对照相比，100、150、200mmol/LNaCl胁迫下MDA含量分别增加30.21%、46.14%和69.13%。3小结与讨论NaCl胁迫对大豆种子萌发的影响发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数都是衡量种子质量好坏的重要指标。发芽率反映种子的发芽能力，可显示种子胚的活性，发芽率高，表示有生活力的种子多，播种后出苗数多。发芽势测试种子的发芽速度和整齐度，发芽势高，表示种子活力强，出苗迅速、整齐、增产潜力大。发芽指数是反映种子发芽活力的指标［17］，能反映种子在胁迫环境下的发芽能力。活力指数是种子活力水平的综合体现，是用来表示种子萌发长成正常幼苗的能力［11］。低浓度的NaCl能促进某些植物种子的萌发，或对种子萌发的影响较小，而高浓度的NaCl则有显著抑制作用。低浓度NaCl胁迫对猎狗［5］、甜菜［18］、棉花［19］、盐角草［20］、黄瓜［21］、大豆［22，23］、甘草［24］等种子萌发均有促进作用，这种现象说明低盐可使大豆种子的呼吸作用增强，提高了蛋白酶和脂肪酶的活性，促进了贮藏物质的转化，进而促进大豆的萌发和生长，而高浓度盐胁迫条件下由于盐所形成的渗透势阻碍了种子吸水的速度，且盐的浓度越高，这种阻碍作用越强，限制了一些水解酶类的迅速合成，影响种子内蛋白质等大分子物质的分解合成进程。NaCl胁迫对大豆种子生理的影响3.2.1保护酶系统的变化SOD与POD是植物体内保护酶系统的主要酶，其主要功能是清除自由基、控制膜脂过氧化和减轻膜系统的伤害。SOD可以催化02-发生歧化反应生成02和H2O2,从而减缓或消除02-对生物体造成的伤害,是保护酶机制中的关键酶；而POD可将H2O2分解为H2O和02，从而将其浓度控制在安全范围之内，消除H2O2对细胞造成的伤害。为了抵御环境胁迫介导的活性氧伤害，植物体中保护酶体系发生了变化。在NaCl胁迫下大豆耐受的盐浓度存在一个阈值（50mmol/L），在这个阈值之上，盐胁迫可能导致大豆胚的极大损伤，而在这个阈值之下，其受到的损伤可能较轻微，因为轻度盐胁迫诱导大豆胚中保护酶活性的提高，特别是POD活性显著升高，表明轻度盐胁迫下，大豆种子能通过提高保护酶活性，以消除胁迫下产生的过多的氧自由基，从而保持胚中活性氧产生与清除之间的平衡，使其免受伤害，同时也反映其对盐的耐受程度；中度和重度盐胁迫下酶活性均下降，导致产生过多的自由基,使得活性氧产生与清除之间的平衡被打破，胚遭到严重的氧化伤害。3.2.2渗透调节物质的变化盐碱生境下种子萌发的最初阶段首先面临的是由于不同盐浓度产生的渗透胁迫［25］，而脯氨酸（Pro）积累是植物体抵抗渗透胁迫的有效方式之一。由于大豆种子中富含蛋白质，因此可能为脯氨酸的积累提供了“源头”，同时脯氨酸是一种重要的有机渗透溶质，它是水溶性最大的氨基酸，具有较强的水合能力，它一方面使细胞保持适当的渗透势而防止脱水，另一方面对生物大分子的结构和功能起稳定和保护作用。3.2.3细胞膜透性的变化膜透性的大小反映质膜受损伤的程度，数值越大质膜受到的伤害也越大［26］。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用的产物，它的表现与膜透性的表现构成一对矛盾的统一体，膜透性是直接反映膜受伤害的程度，MDA间接表示膜受损伤的状况，并兼有反馈作用。盐分能增加细胞膜透性，加强膜脂过氧化作用，最终导致膜系统的破坏。有研究认为，低盐浓度下MDA含量反而比对照低，随着盐浓度的增加，MDA含量呈上升趋势［12，27］。但在此次研究中，随着盐浓度的增加，MDA含量呈上升趋势，与李三相等［13］的研究结论一致。这可能是因为在盐害阈值之下，无论是保护酶系统还是渗透调节系统都能有效地缓解盐胁迫对种胚的伤害，各项指标均表现出积极的响应状态，但当胁迫程度进一步恶化时，酶活性下降，活性氧剧增，导致自由基大量形成，这些自由基尤其是羟基自由基加速了膜的损伤和增大了膜脂上不饱和脂肪酸的过氧化［28］，从而形成大量的MDA。参考文献：［1］ 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