蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化超微结构及细胞色素p4502e1表达的影响

蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化超微结构及细胞色素p4502e1表达的影响

肝纤维是一种常见的慢性肝病病理过程。氧化应激引起的脂质过氧化损伤在肝纤维化发病机制中起着重要作用,是近年来国内外肝纤维化研究的热点。细胞色素P4502E1(cytochromeP4502E1,CYP2E1)是肝脏细胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)药物代谢酶系超家族中重要的参与Ⅰ相氧化反应的酶亚型之一,具有易介导自由基生成,引发氧化应激反应的特性。蓝莓属杜鹃花科越桔属,近年的研究表明,其所含的花青素,多酚类和黄酮类化合物可提高机体抵抗氧化应激的能力,是果蔬中的“第一号抗氧化剂”。本研究以猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型为研究对象,进一步探讨蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化超微结构及CYP2E1表达的影响。材料和方法1.材料表面1.1解冻汁红汁兔眼品种,贵州省麻江县蓝莓基地(国家人事部南方蓝莓种植基地)提供,-20℃保存,临用时解冻榨汁。复方鳖甲软肝片成分为鳖甲(制)、莪术、赤芍、当归、三七、党参、黄芪、紫河车、冬虫夏草、板蓝根及连翘,内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司,批号:20100708。1.2动物中心模型雄性Wistar大鼠50只,清洁级,体质量(180±20)g,购自重庆医科大学实验动物中心,批号:SCXK(渝)2007-000l。普通饲料喂养,自由饮水,自然采光,室温15℃~25℃,实验前适应环境1周。1.3中国科技大学专利无菌猪血清(北京燕生政博生物科技有限公司,批号100115)。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)及还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20101229,20101228,20110215,20101228)。SYBRGreen试剂盒(北京天根生化科技有限公司,批号:J9215)。逆转录试剂盒(加拿大FermentasMBI公司,批号:00090396)。Trizol试剂(美国Invitrogen公司,批号:28205)。EnVision试剂盒(基因科技(上海)有限公司,批号:25F1777A)。电化学发光(ECL)试剂盒(美国Millipore公司,批号1035601)。全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,批号100913)。BCA蛋白定量试剂盒(美国ThermoSCIENTIFIC公司,批号:138546)。CYP2E1、β-actin一抗分别购自英国abcam、美国Sigma公司。β-actin上、下游引物序,列分,别为5,-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3和5-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3,,1536bp。CYP2E1上、下游引物序列分别为5,-GTGACTTTGGCCGACCTGTT-3,和5,-TGAGGATCAGGAGCCCATATCT-3,,766bp,均由上海生工生物工程有限公司合成。1.4检测方法和仪器核酸定量仪(美国AmershamBiosciences公司),核酸扩增实时荧光检测系统(DA7600型)(中山大学达安基因股份有限公司),GelDocEQ凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司),显微图像采集系统(日本Olympus公司),Hitachi7650型透射电子显微镜(日本日立公司)。2.方法2.1大鼠肝脏功能检测大鼠随机分为正常组、模型组、蓝莓原浆预防组(蓝莓组)、复方鳖甲软肝片预防组(复方组)及蓝莓原浆加复方鳖甲软肝片预防组(蓝莓+复方组),每组10只。采用猪血清制备大鼠肝纤维化模型(无菌猪血清腹腔注射,0.5mL/只,每周2次)。造模同时,蓝莓组、复方组及蓝莓+复方组分别予蓝莓原浆(1.0mL/100g),复方鳖甲软肝片(0.054g/100g),蓝莓原浆(1.0mL/100g)+复方鳖甲软肝片(0.054g/100g)灌胃,1次/d。正常组每天予等容量0.9%氯化钠注射液灌胃,每周2次予0.9%氯化钠注射液腹腔注射(0.5mL/只)。12周末股动脉放血处死大鼠,常规留取血清,SiemensAdvia1650全自动生物化学分析仪测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)的活性。留取全部肝脏,称量肝脏湿重,计算各组大鼠肝脏指数[肝脏重量(g)/体质量(g)×100%]。测定各组大鼠肝组织匀浆SOD活性、MDA、Hyp及GSH含量。2.2指标和方法的检测2.2.1肝脏病理组织病理学观察取相同部位肝脏用4%甲醛固定,石蜡包埋,切片,行HE、Masson染色,观察肝脏病理变化并按Ishak方法分期。另取肝组织用3.5%戊二醛磷酸缓冲液预固定,2h后用锇酸缓冲液固定,丙酮逐级脱水,环氧树脂包埋,切片,透射电镜下观察。2.2.2rt-pcr检测cdna表达采用Trizol-酚-氯仿一步法提取总RNA并纯化,测定RNA浓度,逆转录合成cDNA后行RT-PCR。实验过程中以β-actin作内对照,进行标准化转换得到各样本的拷贝数(Ct值)。以Ct值的均数来反映目的基因的表达。2.2.3小鼠肝脏正常组织中苏氏抗体检测采用EnVision二步法,切片常规脱蜡,抗原热修复,CYP2E1抗体(1:200)4℃过夜,二抗37℃50min,DAB显色,苏木素复染。结果判定:肝细胞胞浆染成棕黄色为阳性。每张切片随机选取5个高倍视野(×400),计数100个细胞中的阳性细胞百分比。2.2.4cyp2e1和mcyp2e1蛋白表达水平提取蛋白并测定蛋白含量。取蛋白质样品40μg,10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,CYP2E1抗体(1:500)4℃孵育过夜,二抗(1:3000)室温1h,ECL曝光显影,GelDocEQ凝胶成像仪扫描,QuantityOne软件分析结果。以β-actin表达水平作为内参照。3.．分析发展方差分析采用SPSSl1.5统计软件。计量资料以表示,多组间比较用单因素方差分析,分析前行方差齐性检验,方差齐时用LSD法;方差不齐时用Tambane,s(q’检验);等级资料用秩和检验;P<0.05为差异有统计学意义。结果1.通常，一只老鼠可以在只胸上看到肿瘤和溢出液，并考虑肿瘤引起的死亡3.mda、hyp含量的变化见表2。与正常组比较,模型组大鼠肝组织匀浆SOD活性、GSH含量明显下降(P<0.05),MDA、Hyp含量明显增高(P<0.05)。与模型组比较,蓝莓组、复方组及蓝莓+复方组大鼠SOD活性、GSH含量明显增高(P<0.05),MDA、Hyp含量明显降低(P<0.05)。4.病理组织学检测见表3及图1(见彩插3)。HE染色见正常组大鼠肝小叶结构正常,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。模型组大鼠肝实质广泛破坏,小叶内肝细胞结构紊乱;汇管区弥漫性纤维增生,胶原纤维呈条索状向肝实质延伸形成纤维间隔,分割并破坏肝小叶,少部分病例甚至形成假小叶。蓝莓组肝小叶结构大部分保留,有桥接纤维化形成。复方组无明显纤维化或仅在汇管区周围见少量纤维化(P<0.05)。见图2(见彩插3)。Masson染色见正常组大鼠肝脏有少量蓝色的胶原纤维。模型组大鼠肝组织胶原纤维明显增生、宽大,延伸分布于肝小叶内,肝小叶结构破坏,严重的有假小叶形成。其余各组大鼠增生的胶原纤维明显减少、变细,部分向肝小叶延伸。5.蓝莓及复方组主要病变及部位电镜下可见模型组大鼠肝细胞线粒体肿胀,髓鞘样变(图3A,见彩插3),嵴模糊不清。粗面内质网丧失规则片状结构,明显扩张(图3B,见彩插3)。严重的细胞膜破裂,线粒体、内质网等细胞器溶解,肝细胞间界限消失;Disse间隙内大量胶原纤维沉积(图3C,见彩插3)。蓝莓组、复方组及蓝莓+复方组上述病变明显减轻:粗面内质网呈规则片状结构,扩张不明显,有少量局灶性破裂(图3D,见彩插3);线粒体轻度增生、肿胀(图3E,见彩插3),无明显细胞器崩解现象;Disse间隙内见少量或未见胶原纤维沉积。6.大鼠cyp2e1mrna和蛋白质表达的变化见表4和图4-图5(见彩插3)。与正常组比较,模型组大鼠CYP2E1mRNA和蛋白质表达增高;与模型组比,蓝莓组、复方组及蓝莓+复方组大鼠CYP2E1mRNA和蛋白质表达下降,但差异均无统计学意义。蓝莓可显著提高肝纤维化大鼠的免疫能力肝纤维化的实质是活化的肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)产生的细胞外基质的异常沉积。氧化应激是肝纤维化重要的发病机制。CYP450是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶,是肝代谢药物的主要酶系,其中CYP2E1是CYP450重要的酶亚型之一,与脂质过氧化及自由基生成增多密切相关。肝纤维化的形成伴随着肝细胞超微结构的损伤,氧化应激产生过多的活性氧作用于肝细胞膜及细胞器,引起肝细胞膜功能的异常及细胞器损伤,导致了肝细胞结构和功能的异常,从而引发肝纤维化。蓝莓(Blueberry)是杜鹃花科越桔属(Vacciniumspp.)植物中的小浆果类蓝色水果,因含有丰富的营养及药用保健成分,被誉为“浆果之王”。在英国权威营养学家列出的全球15种健康食品中蓝莓食品居首位,联合国粮农组织(FAO)将其列为五大健康食品之一。美国人类营养研究中心发现蓝莓含有大量生理活性物质,富含花青素,多酚类和黄酮类化合物等其他果品中少有的特殊成分,称其为果蔬中的“第一号抗氧化剂”[16-17]。本课题组前期的研究表明:蓝莓可激活小鼠肝脏的核转录相关因子(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)、Ⅰ型血红素氧化酶(hemeoxygenase-1,HO-1)和醌氧化还原酶的表达,提高T细胞的免疫功能;可通过抑制转化生长因子-β1、下调Smad4及上调Smad7的表达对CCL4所致的大鼠肝纤维化有一定的预防作用;可激活HSCNrf2增加HO-1的表达,抑制体外大鼠原代HSC的增殖和活化。由于猪血清诱导的免疫性肝纤维化与人类慢性病毒性肝炎所致的肝纤维化在发病机制上较为接近。为此本课题采用猪血清诱导大鼠肝纤维化模型,首次将蓝莓用于大鼠免疫性肝纤维化的研究中,从组织形态学、基因及蛋白水平探讨其对免疫性肝纤维化大鼠超微结构改变及CYP2E1表达的影响。实验结果表明,模型组大鼠血清ALT活性与正常组无明显差异,表明免疫性肝纤维化时肝细胞损伤轻,与文献报道一致。与模型组比,蓝莓组大鼠肝纤维化程度、肝细胞线粒体肿胀及内质网扩张减轻,细胞连接及细胞结构恢复;大鼠肝脏指数及肝组织匀浆Hyp和MDA含量降低,SOD活性及GSH水平增加,表明蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化具有较好的预防作用,其作用机制可能与其增加SOD活性及GSH水平,提高了机体的抗氧化能力有关,提示蓝莓作为一种天然水果在肝纤维化的自然医学疗法中具有较高的价值。实验结果表明,模型组大鼠血清ALT活性与正常组无明显差异,表明免疫性肝纤维化时肝细胞损伤轻,与文献报道一致。与模型组比,蓝莓组大鼠肝纤维化程度、肝细胞线粒体肿胀及内质网扩张减轻,细胞连接及细胞结构恢复;大鼠肝脏指数及肝组织匀浆Hyp和MDA含量降低,SOD活性及GSH水平增加,表明蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化具有较好的预防作用,其作用机制可能与其增加SOD活性及GSH水平,提高了机体的抗氧化能力有关,提示蓝莓作为一种天然水果在肝纤维化的自然医学疗法中具有较高的价值。复方鳖甲软肝片是由鳖甲、莪术、赤芍、当归、三七等组成的复方制剂,是目前临床常用的治疗肝纤维化的药物。本实验结果显示,复方组在改善肝组织病理学变化、降低Hyp含量上明显优于蓝莓组,提示该药具有良好的预防大鼠免疫性肝纤维化的作用。而复方组与蓝莓加复方组在肝纤维化程度、肝组织匀浆SOD活性和MDA、Hyp含量上差异无统计学意义,提示蓝莓与复方鳖甲软肝片无明显协同作用。另外,蓝莓组大鼠CYP2E1mRNA和蛋白质的表达与模型组无明显差