异基因造血干细胞移植受者外周血单核细胞趋化蛋白-2和白细胞介素-12水平变化与急性移植物抗宿主病的相关性研究

异基因造血干细胞移植受者外周血单核细胞趋化蛋白-2和白细胞介素-12水平变化与急性移植物抗宿主病的相关性研究

异基因血浆培养（ihd）是治疗血液系统肿瘤最有效的方法。急性移植物抗宿主病(Acutegraftversushostdisease,aGVHD)是allo-HSCT后主要的并发症之一,也是影响患者预后的主要因素之一。目前,临床上主要依据皮肤、肝脏、胃肠道受累症状的出现和程度对aGVHD进行诊断和分级,因缺少特异性的临床症状,aGVHD常与药物的副作用、感染等难以区分。因此,寻找能够直观、及时反映aGVHD发生的免疫学指标,将为aGVHD的预测及早期诊断提供重要依据。已有大量研究发现,在动物体内,单核细胞趋化蛋白-2(Monocytechemoattractantprotein-2/C-Cmotifligand8,MCP-2/CCL8)和白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)参与了aGVHD的发生,但在人体内MCP-2和IL-12是否也参与了aGVHD的发生相关报道很少。因此,本研究采用ELISA法检测20例allo-HSCT患者和16例自体造血干细胞移植患者(Autologoushemapoieticstemcelltransplantation,auto-HSCT)在移植前及移植后不同时间点血清中MCP-2和IL-12的表达水平,以探讨MCP-2和IL-12与aGVHD发生的相关性,为临床早期诊断aGVHD提供可靠的指标。1.对象和方法1.1hla配型与细胞移植2009年7月~2010年11月间在重庆医科大学附属第一医院血液科接受allo-HSCT或auto-HSCT的患者共36例,其中男19例,女17例,中位年龄40(16~64)岁。allo-HSCT患者20例,为实验组,其中急性淋巴细胞白血病(Acutelymphocyticleukemia,ALL)3例,急性非淋巴细胞白血病(Acutemyelocyticleukemia,AML)4例,慢性粒细胞白血病(Chronicmyelocyticleukemia,CML)8例,骨髓增生异常综合征(Myelodysplasticsyndrome,MDS)1例,再生障碍性贫血(Aplasticanemia,AA)4例;allo-HSCT患者中有14例行异基因外周血造血干细胞移植,6例行异基因骨髓与外周血造血干细胞混合移植;HLA配型全相合13例,4/6相合4例,5/6相合1例,9/10相合2例。auto-HSCT对照组16例,其中淋巴瘤11例,AML2例,多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma,MM)3例。1.2主试剂人MCP-2和IL-12ELISA试剂盒由长沙湘宇生物技术有限公司提供;rhG-CSF由华北制药厂生产。1.3外周血造血干细胞培养应用rhG-CSF以5~10μg/(kg·d)经皮下注射,连续注射5~6d,第5天使用血细胞分离机采集外周血造血干细胞2~3次,直至采集单个核细胞数达(2~8)×108个/kg(受者体重)。1.4环磷酰胺cy2.8g/ms/d依据移植类型及原发症选择预处理方案。AML、ALL、MDS患者HLA配型相合移植采用改良Bu/Cy方案,即环己亚硝脲(CCNU)200mg/(m2·d)×1d、阿糖胞苷(Ara-c)2.0~3.0g/(m2·d)×2d;白消安(Bu)3.2mg/(kg·d)×3d、环磷酰胺(Cy)1.8g/(m2·d)×2d;CML患者HLA配型相合移植预处理采用Bu/Cy方案,即Bu3.2mg/(kg·d)×4d、Cy60mg/(kg·d)×2d。AML、ALL、CML、MDS患者HLA配型不相合移植预处理采用改良Bu/Cy方案联用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)2.5~3.0mg/(kg·d)×3d。AA采用FC联合ATG方案预处理,即福达拉滨(Flu)30mg/(m2·d)×5d、CTX50mg/(kg·d)×2d、ATG2.5mg/(kg·d)×3d。淋巴瘤自体移植预处理采用CEAC方案,即CCNU200mg/(m2·d)×1d、Ara-c200mg/(m2·d)×4d、Cy1.5g/(m2·d)×4d、依托泊苷(VP-16)100mg/(m2·d)×4d。MM自体移植预处理采用马法兰200mg/m2,分2~3d口服。1.5诊断和预防agvwd1.5.1疗效判定标准参照美国西雅图FredHutchinson标准;aGVHD疗效标准如下:(1)完全缓解,所有受累脏器分级评分为0;(2)部分缓解,至少1个受累脏器减少至少1个评分级别,而其他脏器无恶化;(3)无效,脏器异常情况进展或无改善。1.5.2csa的移植采用环孢素A(CsA)、短程甲氨蝶呤(MTX)联合酶酚酸酯(MMF)方案。从移植前8d开始使用CsA2.5mg/(kg·d)持续24h静脉滴注,直至患者能口服后按静脉剂量加倍口服,使CsA全血浓度维持在200~400μg/L,峰值维持在800~1200μg/L;移植后1d开始使用MTX(15mg/m2),移植后3、6、11d10mg/m2;MMF从移植前1d使用直至移植后45d,0.5~1.0mg/(kg·d)。1.6植物活性测试植活直接证据有ABO血型检测、性别染色体检测、PCR-STR指纹图。间接证据有造血重建、aGVHD等。1.7抗agvhd分别于预处理前(移植前14d)、预处理后回输干细胞前(移植前1d)、移植后连续8周每周1次取血液标本,对于发生aGVHD的患者在临床症状出现后监测次数调整为每周2次,每次取外周静脉血标本,离心分离血清,于-80℃冰箱冻存备用。1.8免疫总蛋白提取物pahs采用ELISA法。取出板条,留1空白孔,其他孔加血清标本或不同浓度的MCP-2或IL-12标准品,50μl/孔,加入50μl生物素标记的抗体(购自长沙湘宇生物技术有限公司),37℃温育1h;洗涤3次,加入80μl酶结合物(购自长沙湘宇生物技术有限公司),37℃温育30min;洗涤3次,加人100μl底物,37℃避光温育10min;加入终止液,在450nm波长处读取A值。1.9mcp-2、il-12水平应用SPSS18.0统计软件包处理数据,实验中检测MCP-2和IL-12水平呈非正态分布,计量资料采用中位数和四分位数表示,应用非参数检验,组间比较采用秩和检验;MCP-2与IL-12水平首次升高至aGVHD患者临床症状出现的间隔时间属正态分布,采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1中性红细胞0.55555510个/l的中位时间所有患者均获得造血功能重建,移植后中性粒细胞的恢复时间:中性粒细胞>0.5×109个/L的中位时间为11.5d(9~22d);血小板>20×109个/L的中位时间为18d(14~19d)。2.2de度20例allo-HSCT患者中,6例在移植后16~52d内发生aGVHD,发生率为30%,其中Ⅰ-Ⅱ度aGVHD3例,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD3例。Ⅰ-Ⅱ度aGVHD使用中小剂量甲泼尼龙[1.0~2.0mg/(kg·d)]治疗,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD患者首先使用甲泼尼龙[2.0mg/(kg·d)]治疗,无效者使用巴利昔单抗(舒莱)治疗,第1周使用2次,随后连续3周每周1次,每次20mg。2.3患者的血清水平为mcp-2和il-122.3.1预处理前后回输干细胞前血清中mcp-2和il-12水平的变化检测结果显示,对照组和实验组患者预处理前和预处理后回输干细胞前血清中MCP-2、IL-12的水平均无明显变化(P>0.05),见表1。2.3.2回输干细胞前后血清mcp-2和il-12水平的变化检测结果显示,对照组和实验组患者预处理后回输干细胞前和移植后7d时血清中MCP-2和IL-12的水平均无明显变化(P>0.05)。见表2。2.3.4u3000患者血清mcp-2和il-12水平变化检测结果显示,与移植后7d相比,6例aGVHD患者血清中MCP-2和IL-12水平均明显升高,且差异均有统计学意义(P<0.05);经抗aGVHD治疗症状好转后,患者血清中MCP-2和IL-12水平较诊断时均明显下降,且差异有统计学意义(P<0.05),仍稍高于移植后7d,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。aGVHD患者血清中MCP-2水平首次升高时间为移植后11~46d,平均时间为(29.67±11.94)d,此段时间内显著高于未发生aGVHD患者组和对照组(P<0.05);IL-12水平首次升高时间为移植后11~49d,平均时间为(31.33±12.94)d,显著高于此段时间内未发生aGVHD的患者组和对照组(P<0.05)。见表4。3例Ⅰ-Ⅱ度aGVHD患者诊断时血清MCP-2和IL-12均值分别为(189.09±66.63)ng/L和(82.46±8.19)ng/L,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD患者MCP-2和IL-12分别为(312.96±7.65)ng/L和(176.91±63.43)ng/L。Ⅲ-Ⅳ度aGVHD患者较Ⅰ-Ⅱ度患者血清中MCP-2和IL-12水平均值升高趋势更明显。未发生aGVHD患者在移植后的第2~8周血清MCP-2和IL-12水平与预处理后回输干细胞前时比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.3.5mcp-2和il-12水平检测结果显示,有感染而无aGVHD发生和无感染无aGVHD患者血清中MCP-2和IL-12的水平差异无统计学意义(P>0.05),提示MCP-2和IL-12水平的变化与感染并无明显相关性。3.u3000sfd与agvhd的相关性aGVHD的病理过程主要表现为来源于供体的T细胞识别,并通过分泌多种细胞因子攻击受体组织而发生损伤性改变。目前大量研究表明,aGVHD的发生与Th1和Th2细胞失衡相关。IL-12是由抗原递呈细胞所分泌的细胞因子,其不仅能促使Th0细胞向Th1细胞分化,还能使Th2转变为Th1,在调节Th细胞亚群的平衡方面发挥了关键作用。Mohty等研究发现,在减低剂量预处理的allo-HSCT中,IL-12水平高的患者在移植后发生aGVHD的可能性较IL-12水平低的患者大,且IL-12水平与aGVHD的严重程度呈正相关。Ju等研究发现,allo-HSCT后发生aGVHD的患者血清中IL-12的浓度以及基因表达阳性率均显著高于未发生aGVHD患者,且其浓度与aGVHD的严重程度呈正相关。Hirayama等研究发现,allo-HSCT后发生aGVHD的患者血清中IL-12水平升高,尤其在肠相关aGVHD的患者中升高更明显。因此,推测IL-12与aGVHD的发生可能有相关性。aGVHD作为炎症反应中的一种,具有所有炎症的共性,增殖、活化的T细胞向靶器官迁移是造成靶组织损伤的前提条件。趋化因子及其受体在控制T细胞在靶组织中的募集方面发挥重要作用,Palmer等和Hadeiba等研究发现,趋化因子及其受体参与了aGVHD发生。供者T淋巴细胞与宿主APC识别后,刺激分泌炎症因子,这些因子诱导单个核细胞产生MCP-2,再与受体结合后趋化外周巨噬细胞、细胞毒性T淋巴细胞等定向迁移到靶器官,造成靶器官的损伤。Bouazzaoui等检测异基因骨髓移植后发生aGVHD的小鼠中30种趋化因子及其受体在肝、肺、肠组织中的表达发现,MCP-2及其受体在肝和肺组织中超表达,而在肠组织中未表达。许多荣等采用酶联免疫分析法检测31例allo-HSCT的白血病患者在不同时间点MCP-2的水平发现,发生aGVHD的患者在诊断时MCP-2水平明显升高,经抗aGVHD治疗后,血浆中MCP-2水平又明显下降,提示MCP-2与aGVHD有相关性,可能参与了aGVHD的发生。为了明确MCP-2和IL-12与aGVHD发生的相关性,本研究采用ELISA法检测实验组和对照组患者移植前后不同时间点血清中MCP-2和IL-12的水平,结果均提示,MCP-2和IL-12与aGVHD的发生具有相关性,与许多荣等和Ju等的研究结果一致。因此,在allo-HSCT患者移植前后检测血清中MCP-2和IL-12水平,将可能作为aGVHD早期诊断的依据。本实验还发现,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD患者血清中MCP-2和IL-12水平均值较Ⅰ-Ⅱ度患者升高趋势更为明显,提示MCP-2和IL-12水平可能与aGVHD的严重程度相关,但因本实验病例数较少,还有待扩大样本量获得更有说服力的结果。本实验20例allo-HSCT受者中仅有6例出现aGVHD,在今后的工作中我们将累积更多的病例数,并延长